一.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?
原因可能有：
1泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2比例阀失效，更换比例阀即可。
3泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
4溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5系统检漏，找出漏点，密封即可。
6梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
二.请问HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法"
1样品量不足：解决办法为增加样品量
2样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4检测器衰减太多：调整衰减即可。
5检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数
6检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。
7检测池中有气泡：解决办法为排气。
8记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。
9流动相流量不合适：调整流速即可。
10检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
三.液相色谱仪色谱柱使用及维护
每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！
新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。
卡套柱的安装（不加预柱）
1．将卡套架套入柱芯
2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见下图）
3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片
4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧
5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手
注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。
卡套柱的安装（加预柱）
1．将卡套架套入柱芯
2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见下图）
3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片
4．将"子弹头"预柱放入卡套片内
5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧
6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
平衡色谱柱 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。
硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡
如何平衡色谱柱？
平衡过程中，将流速缓慢地提高
用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）
色谱柱的再生 进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。
表1 建议用来冲洗的溶剂体积
注意：
在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
色谱柱的维护
1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化
4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中
6．压力升高是需要更换预柱的信号
每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！
新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。
卡套柱的安装（不加预柱）
1．将卡套架套入柱芯
2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见下图）
3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片
4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧
5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手
注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。
卡套柱的安装（加预柱）
1．将卡套架套入柱芯
2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见下图）
3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片
4．将"子弹头"预柱放入卡套片内
5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧
6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端
平衡色谱柱 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。
硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡
如何平衡色谱柱？
平衡过程中，将流速缓慢地提高
用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）
色谱柱的再生 进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。
表1 建议用来冲洗的溶剂体积
注意：
在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
色谱柱的维护
1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化
4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中
6．压力升高是需要更换预柱的信号
四.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?
关于漂移问题：
1温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
2流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
关于快速变化问题
1流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
2泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
3流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
五.C18柱出什么问题了?买了一根 Kromasil 100－5C18柱，刚开始用时效果较好，条件为30mM KH 2 PO 4 ，pH=2.00，柱温30度。连续使用大约两天后，各标准品峰明显前移。有些原来能分开的峰，现在用同样的条件已经分不开了。最近我继续使用该柱，不同的是每天连续使用时间不超过12小时。使用后先用5%甲醇/水冲洗，再用100%甲醇冲洗。这样使用了三天，峰的保留时间不再前移。因此，我有二个问题： A 峰的前移是由于C18被水解的缘故吗？如不是，又是什么原因呢？ B 对于使用低pH纯水系缓冲盐的C18柱，每天使用12小时，用5%甲醇/水洗净缓冲盐，再用甲醇冲洗，能延长C18柱的使用寿命吗？
使用Kromasil 100－5C18出现这种情况是不了解这种柱子的特性。关于上面的二个问题，作如下分析：
1.峰前移的原因是使用了纯水流动相的缘故。kromasil填料以高碳覆盖量而自豪，在纯水（或水比例大于95%）的环境下因为C18官能团非极性排斥，会使伸展状态的官能团在排斥力的作用下“倒伏”，同时也因极性力形成的张力使“水膜”在填料微孔口形成而覆盖微孔口，这两点都使分析物难以与C18官能团接触，保留时间因此提前。极端情况下，甚至丧失保留性质。不仅是C18，对于Kromasil的其他填料，都反对用纯水（或水比例大于95%）的流动相。
2.其后提到“最近我继续使用该柱，不同的是每天连续使用时间不超过12小时。使用后先用5%甲醇/水冲洗，再用100%甲醇冲洗。这样使用了三天，峰的保留时间不再前移。”，这正是采用了正确的方法。用甲醇或乙腈等纯溶剂冲洗较长时间，可以使“倒伏”的官能团回复其原有状态，之前用5%甲醇水溶液洗去盐再用纯甲醇是非常地道的做法！
3.一般不提倡你所提到的纯水使用环境。非要这样用，我也建议你用预柱，缩短这样的使用 时间，及时冲洗，隔夜封存于纯有机溶剂都是很好的柱维护措施。
另外可考虑是否可在流动相中添加 5%的甲醇或乙腈，如不影响分离情况和峰形的话。 其它类型的C18也有这种现象，只是没有Kromasil柱明显，为了克服纯水溶剂长时间运行产生“水性坍塌”对色谱柱分离造成的影响，现在有新型的色谱柱可以在100％水相中稳定。
六.走空白梯度，在 11-13min出现未知的异常峰，并且峰值还挺大，有机相从0%-100%，这是为什么？
一般走空白梯度是不进样的，大多数情况这些异常峰是流动相本身造成的。在等度洗脱的情况下，流动相的少量杂质一般不会影响基线和噪音，这些杂质要么不出来，要么不间断出来，不会产生异常峰（鬼峰）。对于梯度洗脱，水相或有机相中的强保留杂质在开始洗脱时，由于有机相的比例低，在柱子上保留而不洗脱，但当流动相中有机相比例不断加大，在色谱柱中吸附浓缩的杂质开始被洗脱，从而在某些位置出现异常峰（鬼峰）。还有，如果梯度设置不当，流动相比例变化太快，紫外波长较低时也容易出现异常峰。另外需要注意的是，如果梯度泵的比例阀有问题或流动相混合器效果不好或有少量的气泡存在，也会出现这种现象。因此，对于梯度洗脱，大多数原因在流动相，所以流动相的纯度非常关键，尤其是水的纯度以及添加的流动相改性剂的纯度。
七.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么?
这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺(TEA)，将会使硅醇基的成键能力饱和，从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
现 象 主要原因 措 施
A 输液不稳定 泵的脉流大
1。泵头内进入气泡。
●按pump ，驱出气泡。
●排液管连接口连接注射器抽出气泡。
2。泵头内存有以前的流动相。
●按 pump ，将旧流动相完全清洗出去。
3．吸滤器的管内进入气泡。
●按 pump ，将旧流动相完全清洗出去。
●震动吸滤器，驱出气泡。
●吸滤器网眼堵塞时，用超声滤清洗。超声滤清洗无效时，需更换。(检查吸滤器网眼堵塞的方法 取出过滤部分，记录压力波形。 如果取出后压力波形不正常，则吸滤器网眼堵塞。 )
●对流动相脱气。
4。单向阀工作不正常
●输送异丙醇，清洗单向阀。
●清洗无效时，用超声波清洗单向阀，或更换单向阀.
5．泵头与泵头座之间的缝隙，或清洗液出口漏液
●更换柱塞密封圈。
●更换柱塞密封圈后仍漏液时，更换柱塞。
6．流路的连接处漏液
●用力拧紧公螺母。
●拧紧后仍漏液时，更换公螺母和箍环。
7．流路堵塞，或将要堵塞。
●管道过滤器用超声波清洗，或更换过滤器。
●找出堵塞的部件，更换新部件。
8。柱塞密封圈的使用寿命将到极限。
●更换柱塞。
B 流量比设定值小
1．单向阀工作不正常。
●输送异丙醇，清洗单向阀
●清洗后仍无效时，用超声波清洗单向阀，或更换单向阀。
2．吸滤器网眼堵塞。(*2)
●用超声波清洗吸滤器。超声波清
C 洗无效时，更换吸滤器。 保留时间的再现性不良
1．单向阀工作不正常。
●清洗仍无效时，更换单向阀，或用超声波清洗。
D 高压梯度时2台输液泵的压力表示不一致
(相差在±0．5MPa(5kSf／cm2)或±2％以内属于正常)
1．压力传感器的零点未对准。
●用辅助功能"ZER。 ADJ"，调整零点
2。其中1台输液泵的管道过滤器网眼堵塞。
●用超声波清洗管道过滤器，或更换管道过滤器。
3。2台输液泵的流路合流之前，流路有堵塞的地方
●找出堵塞的部件，更换部件。
E 压力上不去
1．排液阀开着
老兄。谢谢啦！
