完整版液相方法的建立步骤

液相方法的建立步骤
有关样品的情况，明确分离目的？
是否需要特殊的HPLC步骤，样品预处理等？
选择检测器和检测器设置？
选择液相色谱方法；进行预实验；估计最佳分离条件
优化分离条件
检查出现的问题和所需的特殊情况
1.回收纯化的物质 2.定量校正 3.定性方法
论证方法进入常规实验室

开始前应该知道 样品的组分和性质 所含化合物数目
化合物化学结构
化合物分子量
化合物Pka值
化合物UV光谱图
化合物在样品中的浓度范围
样品的溶解度
分离的目的 1.定性还是定量？一种（不希望有的）物质的检出？未知样品组分的确认？纯物质的分离？

2.是否有必要解析出样品的所有成分？
3.如需要定量分析，准确度和精确度需要多大？（精确至±1%-2%

4.该方法需要设计多少种不同的样品基质？特殊化合物可能以不同的样品形式出现（原料药，一种或多种形态，环保样品），是否需要一以上的HPLC方法？单一或类似方法分离不同形态样品是否理想




5.一次将分析多少种样品？
6.即将使用的该HPLC方法中，有那些HPLC设备？实验室人员的操作技能如何？色谱柱是否恒温？HPLC是否能做剃度洗脱？该方法是否可在不同设计的生产设备上运行，尤其柱外峰展宽的老设备上？操作者有怎样的HPLC经历和培训？





样品预处理或检测 1.可直接进样的溶液
2.需稀释，PH缓冲，加入内标或其他定容操作的溶液

3.必须首先溶解或提取处理的固体
4.样品需处理以除去干扰物及保护色谱柱和仪器不受损害

建立分离方法 样品的性质
CE GC HPLC SFC TLC
一般样品 特殊样品
中性的 离子的 无机离子 检测最重要，选离子色谱
研究实验（反向） 异构体 可用一般HPLC（一般柱或环糊精硅胶柱）分开做一般样品处理
等度 对映体 手性条件
剃度 生物样品 肽类
离子对 糖类
NARP 核苷酸
正相 大分子 蛋白质
核酸
糖类
合成聚合物
RHPLC首选条件 色谱柱 15×0.46CM，5μM，C8/C18
流动相 缓冲液（25mM磷酸钾，PH2-3）-乙腈（80：20-0：100），
添加剂 胺改性剂，离子对不用
流速 1.5-2
温度 35-45
样品大小 小于25微升/100微克
目标 分离度 精密和普适好的定量Rs大于1.5
分离时间 5-10分钟日常工作理想
定量 精密度含测小于2%；痕量小于15%
压力 小于150BAR最佳，不大于200BAR
峰高 大信噪比的窄峰最好
溶剂消耗 每次运行少用流动相最好
定量方法论证 专属性
线性
准确度
精密度
回收率
灵敏度
重现性 柱间重现性
方法建立和论证期间可能出现的问题
理论塔板数低 色谱柱选择不对，二次保留，峰形不好的影响
色谱柱易变性 色谱柱选择不对，二次保留
色谱柱寿命短 色谱柱选择不对，样品需预处理，键合相流失
定量精度差 需更好的矫正，找出误差来源
出现新的干扰峰 初步分离不够或初步样品无代表性
强健性（对方法的微小变化的承受能力）
B%微小变化与分离度的关系 B%应小于Rs1.5时的B%值
PH微小变化与分离度的关系 PH应小于Pka
温度的微小变化与分离度的关系 升高或降低温度，考察方法的适用性
方法的普适性 不同的分析人员
实验室
色谱柱
仪器
化学试剂，溶剂
完善方法 1.预备数据表明方法的性能
2.应有其他操作者使用的书面步骤
3.以一个以上的系统或操作者用包括期望组分和期望组分的浓度样品系统的论证方法的性能；比较不同时间和不同实验室之间的数据

4.应得到色谱柱的期望寿命和色谱柱见重现性的数据
5.研究不正常的结果，以纠正潜在的问题
6.研究所有影响分离的条件（温度，流动相组成，PH等）；规定这些条件的限度；对可能发生的问题（关键谱峰对分离不足，随运行时间的延长，最末谱峰保留时间增加等）提出建议措施

方法的论证和移植
影响普适性的因素 实验室/操作人员/设备/试剂
方法论证 准确度 与标准品比较（可获得外源标准品）
被测物回收率的测定（掺入量为正常分析中被测物含量的25，50，75，100，125，150%每个至少重复三次，用25，50，100%较好），分空白加入和减量加入法


精密度 仪器精密度：重复操作中各测定结果间的一致程度，常重复10次以上。

重复性：同一人员在同一条件下对同一样品的不同次测定（非同一次制备）
中间精密度：同一实验室多次使用同一个方法，全部测定结果的一致性（不同日期，仪器，被测物的全分析及多次配制的样品和标准品）。


重现性：研究实验室间的重现性，在协作研究和方法移植实验中进行研究。

线性 衡量响应值和浓度接近一条直线的程度。当浓度超过1个数量级时，往往不呈线性
范围：方法具有准确度，精密度和线性的范围的最高和最低浓度
专属性 在其他样品存在的条件下可准确测定被测样品浓度的能力，通过以下方法可确定方法的转属性。
1.掺入已知干扰物
2.样品降解研究
3.峰收集后再用其他技术进行分析
4.专用线的检测，如：LC/MS或多波长扫描
5.使用另一种色谱分离方式
6.改用HPLC条件
稳定性 使用的样品，标准品，试剂在使用的时间内必须稳定
温度，时间，流动相
系统适用性 每天样品分析之前进行分析。为确保方法产生的结果具有可接受的准确度，精密度的实验测试。

单组分用理论塔板数，多组分用分离度，容量因子
实验室间的交叉研究（可移植性） 用控制批号的样品或参比样品
测定的等同性 t检验，比较两次实验的平均结果或确定样品平均值和标准值是否存在差异。
F检验，比较两次研究的差异。
Q检验，从统计学上剔除不可接受的数据
方差分析