FDA色谱方法验证审评指南

FDA药品审评和研究中心 (CDER)

色谱方法验证审评指南

1994.11 CMC 3

目录

. 绪言
.色谱分类
A.高效液相色谱 (HPLC)
1.手性液相色谱
2.离子交换色谱
3.离子对/亲和色谱

4.正相色谱
5.反相色谱
6.分子排阻色谱
B.气相色谱 (GC)
C.薄层色谱 (TLC)
.参考标准
.药物及其制剂HPLC方法验证的参数
A.准确性
B.检出限和定量限
C.线性
D.精密度
1.重复性
a.进样重复性
b.分析重复性
2.组间精密度
3.重现性
E.范围
F.回收率
G.耐久性

H.供试品溶液的稳定性
I.专属性/选择性
J.系统适用性规定和试验
1.容量因子
2.精密度/进样重复性
3.相对保留时间
4.分离度
5.拖尾因子
6.理论塔板数

K.要点
.注解和结论
.致谢
.参考文献

色谱方法验证审评指南

. 绪言
本技术指南的目的是给审评人员审评验证色谱方法的, 该文件讨论色谱方法的要点和不足, 以便CDER的审评人员能够保证方法的良好性能，也使化学工作者了解为通过审评应给出的足够的信息。国际协调会议（ICH）1993年定义的分析术语，已在这一指南中运用。
色谱方法通常用于原料、药物、药物制剂和生物体液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括手性的或非手性的药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂如防腐剂、分解产物、从容器和密闭包装或制造过程中带入的可提取和可过滤的杂质、植物药中的农药和代谢物等。

试验方法的目的是得到可信赖的和准确的数据，无论是用于验收、出厂、稳定性或药物动力学研究。得到的数据用于药品开发或批准后的定性和定量，试验包括原料的验收、药物和药物制剂的出厂、过程检验(In- process testing)的质量保证和失效期的建立。
方法的验证是由药品的开发者或使用者来检验其方法是否达到预期的可靠性、准确度和精密度的过程。得到的数据成为方法的验证资料的一部分交给CDER.。
方法的验证对于完成机构满足档案要求不是一次性的,开发者和使用者都应验证其方法的耐用度或耐久性（ruggedness or robustness.），其他的分析者、用其它相当的仪器，在其它的日期或地点，在药品生产期限(有效期)全过程，方法都应能够重现。如果产生数据的方法是可靠的，那么所得到的验收、出厂、稳定性或药物动力学的数据就是可信赖的。验证的过程和方法的设计应在开发过程中重要的数据产生之前，如果方法改变了，还应该再验证。

. 色谱类型
色谱是一种技术，通过该技术，样品中的组分载入液相或气相中，通过在固定相上由吸附—解吸附来完成。
A. 高效液相色谱 (HPLC)
HPLC分离是基于在样品在流动相液体和固定相之间的不同分配。一般地说HPLC大体分为以下几种(未考虑其重要性顺序)
1. 手性液相色谱
2. 离子交换色谱
3. 离子对/亲和色谱
4. 正相色谱
5. 反相色谱
6. 分子排阻色谱
1. 手性液相色谱
分离光学异构体可在手性固定相上，用衍生化试剂或在非手性固定相上用流动相添加剂形成非对对映体来实现。用作杂质试验方法时，如果光学异构体杂质在光学异构体药物之前洗脱,要增加灵敏度。
2. 离子交换色谱
分离基于荷电功能团，样品负离子(X ^- )为阴离子，样品正离子((X ⁺ )为阳离子，一般用pH程序洗脱。
　 3. 离子对/亲和色谱
分离基于与目标样品的专一的化学相互作用。更普遍的反相型用缓冲液和加入的对离子(与被分离的样品荷相反电荷)分离。分离受pH、离子强度、温度、浓度和共存的有机溶剂类型的影响。亲和色谱，一般用于大分子,使用配合体（共价结合在固体基质上的生物活性分子)，与其同类的抗原(分析介质)反应，生成可逆转的复合物,通过改变缓冲条件洗脱。
4. 正相色谱
正相色谱为用有机溶剂为流动相和极性的固定相。此时较小极性的组分比较大极性组分更快地洗脱。
5. 反相色谱
报给CDER的最通常的实验方法是反相HPLC方法，最通常用紫外检测器。
反相色谱,一种键合相的色谱技术，用水作基本溶剂,选择性也受溶剂强度、柱温和pH的影响，一般来说较大极性比较小极性组分洗脱更快。
紫外检测器可以用于所有色谱，这类检测器要注意的是灯老化后的灵敏度降低，其灵敏度因(仪器)的设计和/或者制造厂家的不同有小的变异。需要指出,用紫外检检测器和反相HPLC组合得到的色谱图不一定能真实的反映事实，原因是：
·极性比目标化合物大得多的化合物可能被掩盖(在溶剂前沿或死体积时同时洗脱)。
·极性比目标化合物小得多的化合物洗脱出来晚,甚至保留在柱上。
·紫外吸收系数较低和最大吸收不同的化合物在检测相对较低浓度的目标分析物时不能被检出,因为通常只有一个检测波长。
6. 排阻色谱
也叫凝胶渗漉(permeation)或滤过,分离基于化合物分子大小或水动力学(hydrodynamic)容积。比多孔柱填料孔径大得多的分子最先洗脱，小分子进入孔隙洗脱晚，其余的洗脱速率取决于其分子的相对大小。
B. 气相色谱（GC）
气相色谱基于挥发性样品由作为流动相的载气运载，通过色谱柱内的固定相时发生吸附和解吸附过程进行分离。
通常气相色谱分析的样品是低分子量化合物，这些化合物是易挥发的和高温时稳定的。在这一方面，药物和药物制剂中的残留溶剂适于气相色谱分析。生成化学衍生物可达到易挥发和热稳定的目的。
常用的检测器是用于含碳化合物的火焰离子化检测器（FID），用于卤代化合物的电子捕获式检测器（ECD），用于含硫和含磷化合物的火焰光度检测器（FPD），以及用于含氮或磷化合物的氮磷检测器（NPD）。气相色谱也能实现手性分离。填充柱迅速被毛细管取代来改进分离度和分析时间，在气相色谱上分析物位置与HPLC一样,用保留时间（R_t）表示。
C. 薄层色谱（TLC）
薄层色谱是一种最简便普通的色谱技术，分离基于在一端浸于溶剂混合物（流动相）中的薄层板（固定相）上点的样品移动进行分离，整个系统在密封的缸中进行。
对于本身没有颜色的化合物，检出技术包括荧光、紫外和喷雾显色剂（通用的和专一的）。 分析物在薄层板上的位置用R_f值来表示，R_f值为化合物的移动距离与溶剂前沿的比值。
三种方法，气相、液相和薄层中，薄层色谱是最普通的试验方法，因为薄层板上所有的组分都可用适宜的检测技术检出。然而通常不如HPLC那么准确和灵敏。虽然选用适宜的检测技术，TLC法能见到分析的“全图”(whole picture) ，但比HPLC分析变异较大。
. 参考标准品（对照品）
参考标准品为经充分鉴定的高纯度化合物，色谱方法更大程度上依赖参考标准品来提供准确的数据。因而参考标准品的质量和纯度是很重要的，有二类参考标准品，化学的和放射性的。后者应考虑放射标记纯度和化学纯度。
按照提交方法验证的样品和分析数据，指南中的二类化学参考标准品如下：
· USP / NF参考标准品，不需要鉴定。
· 非总目录标准品，应用合理方法制备，并经充分鉴定，以保证其鉴别、含量、质量和纯度达到最高。
应该指出
· 大多数USP / NF参考标准品未标示化合物纯度。
· 对非USP参考标准品，提出纯度的校正数应包括在试验方法的计算中。
· 提供的参考标准品中没有以下杂质，诸如合成过程的结构相似的杂质和其它的过程杂质，如重金属、残留溶剂、水分（结合的和非结合的）、植物来源制剂中的农药和分解产物等。
· 如果在方法中规定，用前参考标准品要干燥除去残留溶剂、非结合水分和有时是结合水（取决于干燥条件），对易潮解的化合物总是包括干燥步骤的。但另一方面干燥可能导致结晶水的损失或引起热敏感化合物的降解。
色谱方法用外标法和内标法进行定量。
A. 外标法
当参考标准品与样品在不同的色谱图上进行分析时，用外标法。定量基于样品的峰面积/高（HPLC或GC）或强度（TLC）与分析对象、参考标准品的比值。
更适合用外标法的样品如下：
1.样品具有单一的目标浓度和狭窄的浓度范围 ，例如验收和出厂检验。
2.简便的样品制备操作。
3. 增加走基线的时间，为检测可能的额外峰，如杂质试验。
B. 内标法
加入一种已知纯度并且在分析中不产生干扰的化合物至样品混合液中，定量基于被分析的化合物与内标的响应比值与参考标准品得到的比值进行比较。这一方法很少用于TLC。
更适合用内标法的样品如下：
1.复杂的样品制备过程，如多次提取。
2.低浓度的样品（灵敏度是确定的），如药代动力学的研究。
3.在样品分析中预计是很宽的浓度范围，如药物动力学研究。
虽然CDER不规定方法应该用内标或外标法用于定量，但一般的看法是用于验收、稳定性和TLC用外标法，对生物体液和GC用内标法。
工作浓度为方法中规定的被分析对象的目标浓度。保持样品浓度与标准的浓度相近可以改善方法的准确性。
建议
1.如果参考标准品的纯度校正因子已知，那么在计算中应该包括。
2.在方法中要规定标准品和样品的工作浓度。
. 药物和药物制剂HPLC验证的参数
虽然许多种HPLC都可采用，但最普遍上报的方法都是用紫外检测器的反相HPLC法，以此作为验证参数的例子。这一方法验证的规定可以扩展到其它检测器和其它色谱。对于验收、出厂或稳定性试验，准确性应最佳化，因为要表明实测值和真值的差异是最为关注的。
A. 准确性
准确性是衡量测量实验值和真值的接近程度。推荐药物和药物制剂的准确性研究在标示量的80%、100%和120%的水平上来进行的，这与“The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation”的规定是一致的。
对于药物制剂，准确性试验通常是将已知量的药物 [按重量或体积（溶于稀释剂）] 以分析对象检测浓度的线性范围量加到空白处方内来完成的。对于液体制剂，这是真实的回收率；而对于诸如片剂、栓剂、透皮吸收制剂等，这不能检测稀释剂中的赋形剂与活性成分间可能产生的作用。实际上要做一个已知活性药物量的单个剂量单位（single unit）来进行回收试验是困难的。准确性试验评价在赋形剂存在时，在分析药物制剂的色谱条件下，试验方法的专属性。但这只是样品制备过程和色谱过程中的回收率，而不是制造过程的影响。
在每个推荐检测浓度重复进样，其重复进样的RSD提供了分析方法的变动性，或是试验方法的精密程度。重复性的均值以标示量的%来表示，这表明试验方法的准确程度。
建议
回收试验在每个水平上（标示量的80%、100%和120%）至少做3份，均数用来估计准确性的，RSD是估计样品分析精密度的。
B. 检出限和定量限
这些限度通常用于药物和药物制剂中有关物质的测定。限度的规定连同药物和药物制剂出厂和稳定性有关的调整杂质量的方法一起要上报。
检出限度是样品中分析对象在实验条件下可被检出的最低限度，但不要求定量。定量限度是样品中分析对象在实验条件下，以可接受的精密度和准确性定量测定的最低浓度。
使用UV检测器时，保证低浓度化合物的检测精密度是困难的，这是由于检测器的灯随着寿命的延长可能逐渐减小其灵敏度，不同检测器制造厂家的躁声水平也不同。在低浓度时，保证每次试验方法能达到检出限度和定量限度是必要的。指定的杂质无对照品，但是又要保证检出限，额外峰可能不出现或出现。对评价额外峰检出的可行的粗糙方法是用以分析对象峰面积的百分比的要求作为检出限。例如检出限要求分析对象峰面积50000的0.01% ，那么给出面积计数为5，则不能检出。
虽然USP表示检出限和定量限分别用躁声水平的2或3和10 倍表示，但这一概念不是很实际的。在方法研究阶段，用不同的检测器分析样品时，检测器的躁声水平是不同的。在定量限水平的试验方法中使用对照品（由申报者提供）能保证杂质可被检出和被定量。
检测器灵敏度因型号和制造厂家的不同而异，见表1。用二种商用检测器分析一种化合物，这些数据不应作为二种检测器灵敏度预期的比例。在设定这些限度时，因为还有起部分作用的其它参数，如灯和柱的寿命，但它们是不知道的。
表1 二种商用检测器的检出灵敏度限度比较

人们应该注意，基线躁声不应解释为额外峰。如果样品的稀释剂与流动相所用的溶剂不同（比例或类型），亦可能在死体积处见到波动。
如果有目标化合物的参考标准品，那么要使用接近定量限的或按规定配制的标准溶液。记录没有参考标准品的杂质峰时，推荐使用药物的稀释液作为参考标准溶液。然后对方法要进行校正，测定的高低浓度都要在药物检出线性范围内，否则用相同色谱图下面积或峰高的%表示是有偏差的。应该注意得到的用面积计数的额外峰不能被认为是取决于该化合物UV吸收系数或吸收度的检出响应。
建议
1. 分析重现性和进样重现性数据应在定量限度范围内。
2. 在试验方法的定量限的浓度处，用一外加的参考标准溶液。
C.线性
符合比耳定律的可检出的线性范围取决于被分析化合物和所用的检测器。工作样品的浓度和准确性试验样品的浓度应在线性范围内。
图1和2表明UV响应和浓度的（a）线性和(b)非线性关系。有一点应该注意，当记录杂质峰时（用母体药物的%面积表示），如果使用非线性的浓度曲线部分，观察到的杂质可能不是理论计数的真实反映。另外，仅当杂质和母体化合物的吸收系数或吸收度值相同时才能得到真实的量。杂质参考标准品通常是必需的。

建议
检测的线性范围取决于试验方法的目的，用于含量测定方法的推荐范围为不得过±20%，以峰面积%计的测定杂质的范围是目标浓度的+20%，低至药物或杂质的定量限。在大多数情况下，回归系数要 >0.999，截距和斜率应标明。
D. 精密度
精密度为在相同分析条件下的一组测量值相互接近的程度。ICH定义精密度含有3个部分，即重复性（repeatability）组间精密度（intermediate precision）和重现性（reproducibility）。在USP 1990 ，1225页中的耐用度（ruggedness）具体体现在这一指南的组间精密度，重现性和耐久性（robustness）概念中。
1. 重复性
a. 进样重复性
灵敏度是检出样品中分析对象浓度小量的变化的能力。灵敏度可以通过系统适用性试验中的进样重现性的规定来部分的控制。
多次注射均一样品（制备的溶液）测量的灵敏度和精密度，表明在色谱条件下测定当天HPLC仪器的性能。这一信息作为验证数据和系统适用性试验的一部分。以百分变异系数（CV%）或相对标准偏差（RSD）的规定来测定其分析的变异限度。值越接近人们可以期待结果更精密或对结果的变化更灵敏。这是假设在系统适用性试验后色谱仪功能未失常的情况下的。然而要注意这不是考虑由药品制造和实验室样品制备引起的变异。作为进样和R _t的变异的例子，表2提供了在进样过程中色谱系统漏液时收集的数据。四个重复的样品分别进样，注意其峰面积的变异和保留时间的漂移。从性能良好的系统得到的一组典型数据见表3。
表2 进样中色谱系统系统漏液时的重复性数据

　表3 色谱系统功能正常时的进样重复性数据

建议
作为方法验证的一部分，建议最少10次进样，RSD≤1%。对于药物或药物制剂中的活性成分出厂和稳定性研究，其RSD≤1%。系统适用性试验的精密度RSD至少5次进样。对低浓度杂质，较高的变异系数可以接受。
b. 分析重复性
分析重复性由同一分析者在相同的实验条件下进行的多次测量，用RSD表示。实际上，它常常与准确性一起进行研究，见 . A部分准确性项下。
2. 组间精密度
组间精密度以前作为持久稳定性的一部分。该数据用来评价在与方法研究过程不同的条件下的方法可靠性。目的是保证同样的样品在方法研究期后进行分析能得到相同的结果。
取根据时间和条件，方法可以在多天、多个分析工作者和多台仪器上试验。
良好的系统适用性试验规定可以部分地保证试验方法的组间精密度。因此设定严格的但实际的系统适用性试验的规定是重要的。
建议
作为最低要求，在 .A部分准确性项下得到的数据可分为二种不同的情况，来表明试验方法的组间精密度。
3. 重现性
按ICH定义，重现性表示协作研究的实验室间的精密度。要求有多个实验室，但由于企业的规模的原因，不总是能实现的。
建议
如果组间精密度完成了，重现性一般不要求。
E. 范围
范围是指被研究的分析对象的高低浓度间的距离。也可见 .A部分的A和C的准确度和线性项下。
.A部分的A和C的准确度和线性项下推荐的范围能用于其它分析对象，如防腐剂。
F. 回收率
回收率是用目标化合物的量或重量在介质中的理论量的百分数来表示的。
目标化合物应该得到全部回收。在样品制备过程中，目标化合物从处方的赋形剂中回收；处方的模型范围包括简单的水溶液至复杂的乳剂 ，同时从对容器或密闭包装如玻璃瓶和定量阀的可能的吸附中回收。通常样品制备过程简单，回收变异小，回收率数据的收集在 A部分准确度项下讨论。
G. 耐久性（Robustness ）
ICH定义耐久性是测量方法不受小的但客观存在的参数变异的影响的能力。耐久性能被良好的系统适用性规定部分的保证。因此设置严格的但可行的系统适用性试验是重要的。
部分或全部改变试验条件，如柱的寿命、柱型号、柱温、流动相中缓冲液的pH、试剂等通常是可以的。
建议
耐久性研究得到的数据一般不上报，但建议作为方法验证的一部分。
H. 样品溶液的稳定性

药物或药物制剂依法制备的溶液的稳定性要按试验方法进行评价，大多数实验室供试品在试验条件下，用自动进样器过夜运行来完成。在试验操作完成前，在实验室环境下，样品在溶液中放数小时。特别要注意能通过水解、光分解或玻璃器皿的吸附而降解的药品。
建议

在常规实验条件下，样品溶液的稳定性的试验应提供一个试验周期的数据，如24小时。在例外情况，样品溶液制备或贮存要多天，那么应该选择一个合适的稳定性试验时间。
I. 专属性/选择性
分析对象应不受其它化合物的干扰，同时与其它化合物也应能很好的分离。应该得到一个代表性的HPLC色谱图或概述上报，该图或概述应能显示加入的已知化合物或加速试验的样品产生的其它峰与母体目标化合物能基线分离。其它峰的的例子如下：
·对于药物或原料，被考虑的有关物质是从合成过程中来的过程杂质（包括异构体）、残留农药、溶剂以及从天然来源中提取的其它成分。
·对于制剂，有关物资可能是存在在活性物质中的杂质、降解物、赋形剂与活性物质的相互作用产物、额外的成分，如从赋形剂或制造过程中引进的残留溶媒；以及从容器和密闭包装或从制备过程中引进的可滤过和可提取的杂质。
药物加速试验的数据要上报，根据申报的药品和“Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods validation”的要求，使用酸、碱水解、温度、光分解、氧化等方法进行加速试验。样品、包括杂质、防腐剂以及空白样品等的加速或不加速的样品的有代表性的色谱图要上报。与杂质试验方法一起，色谱图应表明存在的杂质的检出限 / 定量限要求。色谱图应该是清楚的、有标识的、有时间或时间刻度并且衰减应标明。
注意点
1.主峰可以扩展，如通过增加浓度、改变衰减使可以见到大小合适的额外峰以评价反映稳定性的能力。见.B部分检出限和定量限的建议。
2.基线应在刻度上面 ，因离开刻度的基线（见到的是一条平直的线）可能掩盖小峰。
峰的纯度通过二极管阵列检测器测定，然而目标化合物中存在的低浓度的额外化合物可能不干扰或不影响分析物的UV光谱。
图3和图4说明用二极管阵列检测器的UV光谱图和色谱图。(a)为三维色谱图，(b)为普通色谱图。分析物在4.7分钟流出，应该注意UV光谱图的质量对低浓度化合物是差的。
当用加速试验的样品时，应选择合适的检测器和积分仪，如为能检测0.1%低浓度的降解物，母体峰的检出限至少是0.1%，或面积计数是合理的。
建议
加速和未加速的样品的有代表性的色谱图应上报。包括杂质试验方法、防腐剂等，连同有关的空白样品也一起上报。有代表性的色谱图要以加入已知的额外化合物来标明其选择性。
J. 系统适应性规格和试验