量子点标记在生物分析中的应用

　　量子点（QDs）又称半导体纳米微晶体，是一种由Ⅱ ～Ⅵ族或Ⅲ 一V族元素组成的约2～20 nm的纳米晶粒，具有可调节和对称的发射光谱、光化学稳定性好、激发光谱宽且连续、粒度的不同发射光的颜色也不同等特点，可用于多种标记物的同时检测，极大地促进了荧光标记在生物医学中的应用。该技术具有当前体外和体内标记所没有的独特优势，根据特定的检测对象，可选择合适的生物分子进行修饰，也可修饰抗体检测抗原，或修饰配体定位受体，或修饰探针DNA检测目标DNA等，在生物医学的超痕量分析中具有非常重要的应用价值。在生物学与医学研究领域，探索和发展高灵敏度的非同位素标记检测方法，一直是研究者十分关注的课题。QDs荧光标记技术作为一种新型的标记方法，在很大程度上克服了传统方法的缺陷，尤其在光稳定性和灵敏度方面有了很大提高。荧光QDs的激发波长范围可以涵盖整个光谱，用同一波长的光可以激发不同的QDs，激发后所发射的荧光光谱也很宽，而单个QDs的荧光谱峰狭窄而对称.半峰宽通常只有40 nm。因此，可以同时获得多种颜色的QDs荧光，在生物化学、分子生物学和药物筛选生物大分子相互作用等研究中有极大的应用前景。

　　1.细胞内吞作用（endocytosis）

　　QDs标记在细胞生物学领域的卓有进展的研究是Nie小组在1998年进行的。他们用巯基乙酸修饰的QDs标记转铁蛋白，再与Hela细胞共同孵育，在受体介导下发生了内吞作用，观察到Hela细胞中的量子点。这不仅证明经QDs标记的转铁蛋白仍然具有生物活性，而且证明了QDs的大小能够自然地通过吞噬作用进入细胞。这项研究为以量子点为工具实时监测配体一受体、活细胞的分子转运打下了坚实的基础。

      用QDs标记后的天花粉蛋白（TSC）切割超螺旋DNA证实，QDs标记不影响其生物活性。标记了蛋白的QDs发射光谱发生蓝移。将QDs—TSC与它的靶细胞人绒癌细胞株（JAR）共同孵育，QDs—TSC能以内吞的方式进入JAR。在双光子激发扫描荧光显微镜下，可见QDs—TSC在JAR细胞核周围呈聚集分布。DHLA包覆的QDs与HeLa和Dictyosteliumdiscoideum（Ax2）两种细胞分别混合，2-3小时后都观察了以内吞的方式进入细胞的QDs，而且内吞作用在4℃受到明显抑制。

　　2.细胞膜标记

　　美国量子点公司的研究小组选择活细胞和固定细胞为样本，用两种QDs（QD一535，绿色和QD一630，红色）直接连接IgG，通过报告蛋白Her一3一Mon—oclonal anti—Her2 antibody—IgG—QDs系统，将量子点特异性标记到了表达Her2（癌症Marker）的人乳癌细胞（SK—BR一3cel1）的细胞膜上，并验证了QDs—IgG 标记的非特异性吸附很弱。他们还借助strepavidin—biotin这个天然高亲和性分子对来连接QDs与特定蛋白发现：

①通过QDs—IgG特异性标记的活的和固定的人乳癌细胞，标记特异性和荧光亮度性质无明显差异。

②在鼠乳癌肿瘤组织切片重复以上实验证明，以QDs为探针也能够很好地用于组织切片的标记。这项研究为体外检测癌细胞提供了一个新方法。

　　3.细胞骨架标记

　　1998年，有人提出了半导体纳米晶体将取代有机荧光染料而成为一种优越的荧光探针。他们用CdSe/CdS纳米晶体标记的鬼笔环肽特异性地标记到了3T3小鼠细胞的F－肌动蛋白纤维（鬼笔环肽能特异性地识别细胞骨架的F－肌动蛋白）。在荧光素－鬼笔环肽（荧光探针）和CdSe/CdS纳米晶体双重等量标记的3T3小鼠细胞F一肌动蛋白纤维上，观察到QDs的标记有明显光稳定优越性。但美中不足的是，经过两轮的strepavidin biotin－QD标记，荧光信号仍较弱。绿光QD的量子产率由标记前的24%降低至6%；红光QD的量子产率由标记前的29%降低到5%。美国量子点公司在其后改进了连接方式，用F一肌动蛋白纤维（F—actin filaments）－鬼笔环肽－生物素－链酶亲合素－QD系统标记了小鼠成纤维细胞的细胞骨架Pl。与alivisatos研究小组在1998年所做的研究相比有很大的改进。他们是以strepavidin而非biotin直接连接到QD上，一轮标记就得到了清晰的荧光标记图。连接后得到更高的量子产率，并且未出现QD标记物非特异性吸附到核膜的问题。

　　4 .细胞核标记

　　用strepavidin—QDs（QDs一630，红色）标记抗核抗原抗体，strepavidin—QDs（QDs一535，绿色）标记微管蛋白，可以看到红色QDs锚定在细胞核上，而绿色QDs标记了细胞骨架。得到了清晰的双色QDs标记的细胞图片。证明连接了不同的特异性分子的不同光谱特征的QDs能够同时应用于细胞标记。

　　5 QDs标记对细胞的生长和发育的影响

　　将QDs埋人磷脂封闭的共聚合微束中，Du—bertret等⋯1得到了在缓冲体系中稳定分散的QDs。他们选取蛙胚这种易获得的好材料研究QDs标记对胚胎发育的影响。将QDs微束注射人8分裂的蛙胚的个别细胞，直至其成长为蝌蚪。发现QDs定位于注射的细胞中，不发生细胞间的迁移，但可以随分裂传至子代细胞中，并且能常久地稳定存在。注射适当数目的QDs（2xl09 QDs/ cel1）对蛙胚细胞的运动、细胞成活率及发育都没有影响。aiswal等研究小组对QDs标记的体外培养细胞的生长和发育做了研究。他们采取两种方式标记细胞。① 内吞作（endocytosis）：直接把QDs与HeLa和dictyostelium discoideum 两种细胞分别混合，使其进入细胞。标记后的活细胞甚至能稳定生长（>12 d），而标记物也稳定存在。② 不依赖于内吞作用。用一种非膜通透性的偶联试剂sulfo.NHS.SS.biotin将细胞表面生物素化，再与avidin.QDs混合，能观察到细胞表面被QDs标记。继续保温2 h后，发现原来标记在膜上的QDs大多聚集在细胞核周围，说明QDs可以随细胞内吞自身表面蛋白时被带人细胞内而不是被迫吸人，而且不影响细胞的生理活性。这一方法可以用于不经历内吞的细胞的标记。在研究QDs对细胞发育的影响时，他们利用饥饿细胞对cAMP源的趋向性，观察D.discoideum 细胞在cAMP周围形成了明显的聚集环，说明标记对细胞的发育无影响。对QDs标记的体外、体内细胞的生长发育的研究，均证明了QDs作为荧光标记物的低毒性，QDs的生物稳定性和荧光稳定性，也为发育学研究提供了一个更为方便和快捷的手段。

　　6.组织学探索

　　美国加利福尼亚大学对活体组织中的QDs标记物进行了研究。利用QDs标记筛选得到的高亲和力的肽配体从尾静脉注射人培养的肿瘤小鼠模型中。观察组织切片，在肺组织、肿瘤血管和淋巴管均观察到了相应的亲和短肽的标记。而在肾和脑组织切片中，没有非特异性吸附。在此研究中还观察到，吸附到组织细胞表面后，QDs标记物有部分被吞进细胞内。高特异性和内吞作用的结果无疑为药物的靶向递呈研究提供了一个新的途径。

　　7.用QDs进行大规模组合标记

　　目前，在基因组学和蛋白质组学的研究已经取得了大量的序列数据，为此需要寻找一种有效、快捷的检测分析技术来筛选核酸和蛋白质，利用QDs的多重性和多强度性质能够对生物分子群进行大量平行编码标记。

      例如，用单波长（色）和10 种不同强度的QDs可产生9种特征编码（10 -1），如果取6色10强度组合将产生百万种编码标记，虽然由于光谱重叠等原因实际上编码数量低于理论值，但可用的编码数量足以满足人们对蛋白质、核酸等生物分子群的标记。

      短短几年的研究显示，该项技术有着极其广阔的应用前景。客观地估计，QDs技术产生的影响在几年之后将超过DNA芯片而与PCR齐名，成为蛋白质组学研究蛋白质间相互作用的核心技术，使蛋白质组学研究以及细胞生物学、新药筛选和病理诊断等领域在数年之内取得大幅度突破性进展。尤其是发展生物分子群的标记方法，标记和识别种类繁多的生物分子需要大量平行的编码标记。

      在大规模标记构想的驱使下，许多科研小组都进行了尝试。如：

Fulton等用两种荧光染料编码约100个微球，用于多分析物的多重生物化验。

Walt研究小组以荧光编码微球随机编排了纤维一光学微阵列。但他们所用的标记物都是有机染料或镧系复合物，有很大缺陷。相比之下，半导体纳米量子点具有宽范围的激发波长、窄而对称的发射光谱、多样可调的光谱性质和稳定的荧光强度，这些特征都使之成为未来生物分子标记的首选。

Han等综合考虑复合球的荧光效率，内部量子点的光谱重合等因素，用5 ~ 6种颜色，6个强度级别（0 ~ 5）的QDs任意组合成三色标记球，能产生10,000 ~ 40,000个可识别编码。实验证明，微球大小均匀，组合成微球的QDs荧光强度与游离QDs相同，QDs之间光谱稳定，没有能量转移。他们用这种微球特定标记多种DNA探针，结合使用荧光染料来标识靶DNA的位置得到了很好的序列分析结果。将这项以半导体纳米粒子为多重标记的技术应用于基因组学、蛋白质组学、组合生物学和组合化学，面对多样的生物（化学）分子，科研人员可以真正实现海量对海量的标记和研究。更灵敏地检测技术，如双光子激发激光扫描显微术及更细微的滤光设备的使用必将推动生物医学研究的深入。