血液学

　　血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等;用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血;检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。

　　l 血液学应用：DNA倍体分析及细胞周期分析

　　在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N，为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。细胞经固定后用PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图。

　　l 血液学应用：淋巴细胞亚群测定

　　淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 (CD3+), T 辅助细胞 (CD3+CD4+), T 抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞(CD19+或CD20+)，NK 细胞 (CD3-CD56+)等。

　　常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗体,有直标荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应<2.0%。

　　三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:如真正的T 辅助细胞应是 CD3+CD4+CD8-, 真正的T 抑制细胞应是 CD3+CD4-CD8+,单标CD8+细胞中不仅有T 抑制细胞,还含有30%左右的NK细胞;而CD3+CD4-CD8-细胞群是γδT细胞,此类细胞与感染有关, CD3+CD4+CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞+CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。如单标记CD56不能准确测定NK 细胞,NK 细胞应是 (CD3-CD56+),因为CD56+细胞中包含着非HLA束缚细胞毒T 细胞(CD3+CD56+)。双色组合还能测定B 淋巴细胞(CD3-CD19+或CD20+)、激活的T 细胞(CD3+CD69+或CD3+25+)等。

　　应用适当的双色组合如CD4与CD29,CD4与CD45RA,可以测定T辅助细胞的的亚群。如CD4+2H4(CD45RA)+细胞是Ts的诱导细胞;CD4+4B4(CD29)+细胞Th的诱导细胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可测定T抑制细胞的亚群。

　　T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4，可区分Th1细胞(CD4+/ IFN-γ+)和Th2细胞(CD4+/ IL-4+)。

　　利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴细胞标记双色或三色标记还可测定淋巴细胞亚群的功能状态，如活化T8、活化B细胞等。

　　以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考,请注意同一CD中有多种克隆的McAb, 同一CD中不同McAb所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值。

CD3+	70.0±12.0%	+4B4+	23.0±7.0%
CD3+CD4+CD8-	40.0±9.0%	CD4+2H4+	19.0±6.0%
CD3+CD4-CD8+	30.0±8.0%
CD3-CD56+(NK)	12.0±8.0%

　　　l 血液学应用：白血病免疫分型原理

　　白血病免疫学分型是利用单克隆抗体(McAb)检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型,为诊断和治疗提供依据。白血病免疫分型是形态学分型的重要补充和进一步深化，国际MIC分型协作组认为每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型对鉴别急淋和急非淋有决定作用，对鉴别急非淋的某些亚型如M7、M3也有决定作用，对于一些用形态学、细胞组织化学不能诊断的急性白血病，急性未分化白血病，混杂性白血病等有重要意义。自从单克隆抗体问世以来,最成功的应用就是研究造血系统各类细胞表面抗原与细胞增殖、分化及恶变的关系。研究发现细胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作为细胞生长因子的受体而影响细胞的增殖分化;一些抗原分子作为细胞间相互识别的物质基础而参与细胞间相互作用;一些抗原分子则是细胞特异功能的物质基础。

　　从多能造血干细胞(PHSC)分化成熟为功能细胞过程中, 细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断发生改变, 这些抗原称为造血细胞分化抗原。造血细胞分化抗原是造血细胞分化过程中由细胞核内染色体上的基因编码的镶嵌蛋白, 其出现、增多、减少或消失与造血细胞分化密切相而表现出与细胞系列及分化程度相关的特异性。这些抗原可作为鉴别和分类造血细胞的标记。如髓系细胞的MPO、CD33、CD13、CD14、CD15等抗原;巨核系的CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴细胞的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗原;B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未发现白血病细胞特异性抗原，而白血病细胞是造血细胞在某一分化阶段的大量积累,表达与之相应的造血细胞分化抗原，因此可用造血细胞分化抗原类标记检测白血病细胞; 但白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同。常有丢失某一分化发育阶段正常应有的抗原,或表达某一分化发育阶段正常不应有的抗原，或表达其他系列抗原，部分丧失了系列专一性和分化的严格性。

　　用FCM检测白血病免疫分型具有快速、简便、重复性好等优点。由于FCM可根据FSCνSSC直方图区分细胞并可圈定检测细胞范围(Bitmap，无定型门),或用SSC(线性或对数)和CD45直方图圈定检测细胞范围(Bitmap，无定型门)，排除其他细胞干扰，因此较光学显微镜免疫荧光法或免疫组化法结果更准确。

　　血液学应用： 白血病免疫分型其临床意义

　　目前公认的系列特异性指标是:T淋巴细胞系--胞浆CD3(cCD3),B淋巴细胞系-- cCD22或cCD79，髓系---MPO 或cCD13,一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。

　　1. ALL的免疫学分型

　　1986年前分为普通型ALL(cALL)、未分化细胞ALL (Null-ALL)、T细胞ALL( T-ALL) 、前B细胞ALL (PreB-ALL)、B细胞ALL (B-ALL)五型;1986-1994年分为两大类九型(非T-ALL六型,T-ALL三型),九十年代后期有人按临床实用性一般分为B祖细胞ALL、前B细胞ALL、B细胞ALL、T细胞ALL四型。

　　B-祖细胞 ALL :B-祖细胞ALL 占儿童ALL的65%-70%,青少年ALL的55%-60%,成人ALL的50%,儿童ALL >90%病例 CD10+，而婴儿CD10+病例<50%。FAB分类为L1、L2，白血病细胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19阳性，大多数病例CD24、CD34阳性，本型细胞膜免疫球蛋白(Ig)阴性。此型有CD10+、CD10-两个亚型，CD10+型预后较CD10-型好。

　　前B 细胞ALL ：前B 细胞ALL在发育阶段上较B祖细胞 ALL晚，占儿童ALL的25%，在成人ALL占的比例还不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、 CD10、cCD22阳性，CD34阴性,鉴别特点时有胞浆重链μ。此型预后较B祖细胞ALL差，可能与t(1;19)有关，t(1;19)占前B 细胞ALL的25%，此型CD34-，而B系列ALL中CD34-是独立的预后不良标记。

　　B细胞ALL ：B细胞ALL 占所有ALL 的2%-5%;B细胞ALL更为成熟，白血病细胞的FS和SS较B-祖细胞 ALL明显增加，在FSνSS直方图或SS(线性或对数)νCD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区域。典型标记是细胞膜免疫球蛋白(sIg)阳性,表型一般为CD19、CD20、CD22、CD24阳性,多数病例CD10+，但sIg和成熟抗原出现可区别于更早的B系ALL。此型FAB分类一般为 L3,罕见病例有B细胞ALL标记而FAB分类一般为 L1，这些病人多有t(1;19)和t(14;18)。

　　T细胞ALL ：T细胞ALL占儿童ALL的15%,成人ALL的25%。多数表型为胸腺细胞型，最常见的是晚期胸腺皮质细胞亚型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表达较少，TdT常阳性;另一常见亚型是早期胸腺皮质细胞亚型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓质期亚型较少见，CD2+、CD5+、CD7+，CD3+CD4+或CD3+CD8+，TdT表达较少。前T细胞亚型，仅有CD7和cCD3而无其他T系抗原表达，预后较差。T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。成人T细胞ALL预后较好，而儿童T细胞ALL较儿童B-祖细胞 ALL和前B细胞 ALL预后差，虽然各亚类预后仍不甚明确，但CD10阴性者预后不良。

　　ALL 的免疫学分型经过1986年前分为五型，1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期(1997)分为四型的过程。1986年前的五型，是当时单克隆抗体和检测手段的反映;随着新的单克隆抗体(主要是T、B淋巴细胞亚群的McAb)的发现和临床大量病例的检测，不仅弄清了T、B淋巴细胞的来源、分化发育过程，而且使免疫分型更加细致，因而出现了1986-1994年分为两大类九型;但按照细胞的分化发育阶段分型的两大类九型分型法对临床略显繁琐，指导治疗、判断预后临床实用性也不够强，因此又出现了以上简单的四型分类法。经过对比不难看出，四型分类法的B-祖细胞ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3个亚型，而Ⅴ型即是前B 细胞ALL型，Ⅵ型是B 细胞ALL型;而T细胞ALL型是两大类九型中T-ALL的三型合并为一型。两大类九型分类法的非T-ALL的Ⅰ型分类为急性未分化白血病(见后)。

　　ALL也可按DNA含量分类，用流式细胞仪很容易测定DNA含量，DNA含量分为两个亚类：超二倍体和亚二倍体，前者预后好，后者预后差。

　　2.急性髓细胞白血病(AML)攪

　　目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化发育阶段特异性,因此AML的免疫学分型FAB-M0、M1、M2界限不十分明显;但M3多不表达HLA-DR和CD34，常表达CD13、CD33、CD9、CD38;GPA在鉴别红白血病(M6)时可提供帮助;巨核细胞白血病(M7)则有CD41、CD42、CD61为系列特异标记,为确诊的重要指标。由于白血病的异质性,同一FAB分类的白血病抗原表达并不完全相同。

　　M0：M0白血病细胞的FS和SS都很低，在SSνCD45直方图中处于原始淋巴细胞区域。M0的白血病细胞至少表达一个髓系特异性标记如MPO、CD13、CD116，MPO较CD13、CD116更敏感;一般淋巴系标记是阴性的，但可能表达CD7或CD4;一般CD34、HLA-DR阳性。有研究显示AML复合表达CD7和CD34预后不良。

　　M1：M1的白血病细胞抗原表达类似于M0并与M0不好区分，M1一般表达CD13，CD33和HLA-DR，CD34表达较M0少，部分可能表达CD15，较少病人可能表达CD4。

　　M2：M2与M1的主要区别是分化成熟增加，原始细胞减少;CD34表达较M1少，CD15表达较M1增加，大部分病例HLA-DR阳性，CD13表达强于CD33;部分M2表达CD19和CD56伴有t(8;21)，罕见的伴有t(8;21)的M2不表达CD13，CD33和CD14但MPO阳性。

　　M3：M3白血病细胞由于它的高颗粒性而SS增大;M3的白血病细胞一般表达CD13，CD33，部分病人可能表达CD2，但HLA-DR阴性，CD34一般为阴性，复发病人阳性;部分病人可能表达CD56，表达CD56者应作基因检查(APL/RARα)以排外髓/NK细胞急性白血病(详见后)。

　　M4、M5：M4、M5的免疫表型相似，重要表型特点是表达CD13、CD33、CD14、CD15和HLA-DR，部分病人表达CD4、CD7,部分病人可能表达CD56，表达CD2多为M4E0，常伴有16号染色体异常，预后好。

　　M6：M6较少见，一般表达HLA-DR、CD34、CD13、CD33，GPA对确定红系有用。

　　M7：M7占成人ANLL的1%、儿童的4%。成人M7多见于二次性白血病,即CML.BC或MDS-RAEB或MF白血病变。而儿童M7多为原发。M7免疫学表型一般为:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特异性标记CD41、CD42、CD61阳性可确诊M7，但要注意排外血小板粘附于细胞上的假阳性结果。

　　3.急性未分化白血病 用流式细胞仪分析仅有大约1%的急性白血病不能分类，典型急性未分化白血病仅有HLA-DR和CD34表达而无系列特异性抗原表达。

　　4.杂合型白血病 真正的双系列表型白血病是伴有t(9;22)或有11q23 MLL(myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia髓/淋系或混合性白血病)基因重排的病人，以往报道的许多杂合型白血病多是由于方法学问题不能排除非白血病细胞的干扰，或将非特异弱表达当作特异表达，如前所述白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同，部分丧失了系列专一性和分化的严格性，因此不要轻易定型杂合型白血病，国际上杂合型白血病尚无统一诊断标准。

　　5.慢性粒细胞白血病急性变(CML BC) 慢性粒细胞白血病(慢粒 CML)是一种多能造血干细胞疾病,其转归多为急性变。慢粒急变(CML BC)涉及所有造血细胞系列,往往不易从形态学上确定急变类型, 50%-60%为AML变,30%左右为ALL变。AML变可表达AML的所有表型，大多数ALL变为B细胞来源,其中cALL及前B-ALL多见,罕见T-ALL变。

　　6.B 淋巴系细胞增殖性疾病

　　B 淋巴系细胞增殖性疾病中包括B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B幼淋细胞白血病(B-PLL)、毛细胞白血病(HCL)和多发性骨髓瘤(MM)/浆细胞白血病和部分淋巴瘤，淋巴瘤免疫分型将在不同章节中描述。

　　B-CLL：B-CLL的白血病细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79a，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。

　　B-PLL ：流式细胞仪在区分B-PLL和B-CLL中十分有用, B-PLL通常sIg表达强, CD5阴性而CD22阳性,困难的是原发B-PLL和由B-CLL转化为B-PLL的区分, 由B-CLL转化来的B-PLL CD5阳性而CD22表达弱,类似于B-CLL。

　　HCL：HCL 一般表达成熟B细胞标记:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg，CD11c、CD22高表达，CD25中等度以上表达，一般CD21-，典型病例CD5-、CD10-、CD23-，但有少数病例可阳性。CD103是HCL最可信的标记，可用来与其它B细胞白血病鉴别。

　　浆细胞瘤：由于大多数多发性骨髓瘤病人骨髓标本中含骨髓瘤细胞少及瘤细胞丧失了大多数B细胞系特异性标记，用流式细胞仪分析多发性骨髓瘤(MM)/浆细胞白血病较为困难，典型的浆细胞CD38强表达而CD45弱表达。一般浆细胞sIg弱表达,cIg阳性。

　　7.T淋巴系细胞增殖性疾病

　　T淋巴系细胞增殖性疾病中包括T幼淋细胞白血病(T -PLL)、NK细胞白血病(T-LGL、NK-LGL)和成人T淋巴细胞白血病(ATL)、T慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)。

　　T-PLL ：T-PLL的白血病细胞一般表达CD2、CD3、CD5和CD7，大多数病人CD4+ CD8-,但偶有CD4+ CD8+,单独表达CD8者少见, 本病常伴有14q11和14q32改变, 有CD4+ CD8-表型者预后较好,本病较B-PLL恶性度高。

　　NK 细胞白血病 ：NK系列白血病最早描述的是大颗粒淋巴细胞白血病(LGL), LGL有两种类型：T-LGL和NK-LGL，T-LGL表达CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而CD56、CD5、CD7、CD4和CD25多阴性，有TCR基因重排。NK-LGL表达CD2、CD16和CD56，而CD3、CD4多阴性，CD8、和CD57弱表达或阴性，无TCRα-β基因重排。最近NK系列白血病又有新的亚型发现，如急性前髓系/NK 细胞白血病、急性髓系/NK 细胞白血病、原始NK 细胞白血病、NK样T细胞白血病。急性前髓系/NK 细胞白血病是一种最近认识的不同类型的白血病, 其特点是有明显髓外涉及,不成熟的原始淋巴细胞样形态,伴MPO--、CD7+、 CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,预后不良。急性髓系/NK 细胞白血病，形态学和免疫表型类似于M3,但无RARα基因重排，一般HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+，多见于老年病人，对维甲酸无反应。原始NK 细胞白血病，无髓系和淋巴系抗原，CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、CD7+/-，少数有TCRβ基因重排，而无TCRγ-δ基因重排。NK细胞系列白血病的新亚型是近10年才较多注意到的白血病,其临床特点,免疫表型,染色体及基因改变需进一步积累病例研究才能彻底明了。大约10%-20%左右的急性白血病表达CD56，除了原始NK 细胞白血病、NK样T细胞白血病、急性髓系/NK 细胞白血病、急性前髓系/NK 细胞白血病外，大部分表达CD56的急性白血病是FAB分类的M2、M3、M4、M5型，这类病人究竟是急性髓系/NK 细胞白血病还是急性髓系细胞白血病伴NK抗原表达有待进一步研究，鉴于急性白血病部分丧失了系列专一性和分化的严格性，可能称为急性髓系细胞白血病伴NK细胞抗原表达较为合适。

　　成人T淋巴细胞白血病(ATL)：大多数ATL细胞表达激活T细胞表型：CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、TCR，一般CD7-和CD8-,常有粘附分子L-选择素的异常表达; 伴有p53异常者预后不良。

　　T-CLL：T-CLL少于CLL总数的1%，细胞形态学类似与一般CLL，但临床发展较快，但多数病人表达CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、少数病人表达CD8。

　　l 血液学应用：淋巴瘤免疫分型

　　目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法, REAL分类法是以肿瘤发生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型,以了解被测淋巴瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地做出检测，在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。

　　临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中常可遇到以下四种情况：①B细胞系淋巴瘤②T/NK细胞系淋巴瘤③淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤④造血细胞以外的肿瘤。

　　1. B细胞系淋巴瘤 大多数情况下, B细胞系淋巴瘤CD19、CD20阳性，分化早期CD20阴性，CD10、CD34阳性;分化晚期CD5、CD23阳性，成熟为浆细胞后以上标记均阴性。利用单克隆抗体κ、λ(正常时κ：λ=2：1)可检测免疫球蛋白轻链的偏移，推断是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6. 列出了外周B 淋巴系淋巴瘤的4种类型的免疫分型。

　　SLL(small cell lymphocyte lymphoma)--小细胞淋巴细胞淋巴瘤: 小细胞淋巴细胞淋巴瘤细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79，CD5与以上抗原复合表达，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。

　　MCL(mantle cell lymphoma)--斗篷细胞淋巴瘤：MCL包括以前分类为中等淋巴细胞淋巴瘤(ILL)、中度分化淋巴细胞淋巴瘤(IDL)、中心细胞淋巴瘤和套区细胞淋巴瘤(MZL),占淋巴瘤的2%-8%，λ型较κ型常见， sIgM中度表达,IgD弱或阴性，表达CD19、CD20、CD22、CD43，但多数病例CD5阳性CD23阴性，CD10一般阴性，CD5阳性CD23阴性和Ig类型可帮助鉴别MCL和FCL。

　　FCL(Follicular center cell lymphoma)---泸泡中心细胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的45%，表达CD19、CD20、CD22， sIg强表达,但多数病例CD10和CD23阳性，典型FCCL CD5、CD43和CD11c阴性。CD10阳性、CD11c阴性和sIg强表达利于与MZL鉴别。

　　MZL(Marginal zone lymphoma)--边缘带淋巴瘤和相关B 细胞淋巴瘤：典型免疫表型: CD19、CD20、CD22、HLA-DR阳性，sIg中度表达，CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，多数表达CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，利于与CLL/SLL、FCCL、MZL鉴别。

　　2. T/NK细胞系淋巴瘤 早期T细胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3阳性。T/NK细胞系淋巴瘤的详细分类及表型参见表12.8。细胞膜CD3阳性可确认为外周T细胞肿瘤, 外周T细胞肿瘤的特征是CD3与CD4或CD8复合表达，并常有克隆性T细胞受体，或α-β型或γ-δ型;

　　MF(mycosis fungoides)--蕈样真菌病和sezary综合症:占皮肤淋巴瘤的绝大多数，CD4阳性，同时表达CD2、CD3、CD5，有时CD7阴性，CD8阳性病例极少见但已有报道，有无TCRβ基因重排对鉴别淋巴瘤和炎性反应有帮助。

　　LCL(large cell lymphoma)--大细胞淋巴瘤: 大细胞淋巴瘤(LCL)占成人淋巴瘤的40%，儿童的1/3，成人80%是B细胞型的，儿童B细胞型和T细胞型各占一半。

　　3. 淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤 急性髓系细胞白血病(特别是M4、M5)淋巴结转移时有发生，如T、B淋巴细胞标记低表达应怀疑并按白血病免疫分型处理。

　　4. 造血细胞以外的肿瘤 检测淋巴结、胸腹水标本时如遇CD45阴性情况应考虑非造血系统肿瘤淋巴结、胸膜、腹膜转移。

　　血液学应用： 红细胞疾病诊断

　　(一)网织红细胞测定

　　计数外周血中网织红细胞数量,对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。有核红细胞在成熟过程中,脱去细胞核后仍有少量RNA残留在细胞浆内,再经过约一天时间残留RNA完全消失,成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的网织红细胞出现在外周血中,正常值为1.0～1.5%,上限3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用网织红细胞绝对值表示,正常值5～15×1010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色(最常用亚甲兰),然后在显微镜下计数,计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:①可避免由于细胞核的碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高②可避免人为误差③因为可在短时间内测量上万个细胞,结果较常规方法准确、可靠,④同时可给出网织红细胞年龄结构。

　　流式细胞仪测定网织红细胞方法简单,只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光染料有焦宁Y(Pyronin Y) 丫啶橙(Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。

　　(二)PNH诊断

　　阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)因血细胞膜上锚固蛋白-糖磷酸肌醇(GPI)减少或缺乏而导致与GPI有关的补体激活抑制因子如CD55、CD59减少或缺乏，因而红细胞对补体异常敏感发生溶血。流式细胞仪检查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59双阳性细胞>95%，PNH病人CD55、CD59明显减少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感。

　　l 血液学应用： 血小板功能分析和血小板病诊断

　　(一) 血小板功能分析

　　血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板颗粒膜糖蛋白CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态，如CD62p、CD63正常血小板不表达，当血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血小板。

　　(二)血小板病诊断攪

　　1.血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体(包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间,这些自身抗体多为针对HLA-Ⅰ类抗原决定簇的抗体,一般是IgG,它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板。因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的。许多不同的利用放免、荧光、酶、SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂、费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用FCM测定血小板抗体的方法具有快速、简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示);同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图,使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。

　　FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O型血小板作用后用FCM测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。

　　2.血小板无力症 血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41、CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，还可测出GPIIb/IIIa减少程度，分类血小板无力症。

　　3.巨大血小板综合征(BSS):血小板巨大, CD42a减少，CD42b减少，CD61 增加。

　　l 血液学应用：微小残留白血病检测

　　微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR)后体内残留少量白血病细胞的状态。微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确界限,仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012,经治疗获CR后≤1010,因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10攪。MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义: ①指导临床治疗②预测白血病复发③评价自体骨髓移植的净化效果。应用FCM检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点。

　　由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高，一般仅有1/103-104。目前主要有两类检测方法: ①用FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性仅1-5%。②免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约0.1-1%。

　　假阴性结果可能由于: ①标本中的白血病细胞<10-4攪或<10-5;②所取标本不能代表全身骨髓情况; ③病人白血病细胞表型转换。

　　l 血液学应用：白细胞吞噬功能测定

　　粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。以下简要介绍FCM测定白细胞吞噬功能的概况。

　　应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性。用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定,结果准确可靠。

　　目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明).

　　以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血与目标粒子200μl(目标粒子浓度4×107/ml)置37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37°C温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25分钟,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。

　　应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小;此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用FITC标记的单克隆抗体 CD13、CD14、CD15标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究。

　　血液学应用：NK和LAK细胞活性测定

　　NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。

　　LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。

　　常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多,如攩51Cr释放法、[3H]TdR参入法或释放法、LDH释放法、ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利,利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986年就开始摸索,方法已趋于成熟,以下介绍其中一种:

　　肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净,调整细胞浓度为106/ml,为效应细胞;靶细胞分别为K562和HL-60或HeLa细胞,在对数生长期受集细胞,调整浓度为106。用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)标记靶细胞,效应细胞:靶细胞(E:T)为40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死细胞,洗净后即可上机检测。DiO发绿荧光,PI发红荧光,利用双参数(FL1vFL2)直方图可清楚地了解靶细胞中的死亡细胞,计算出靶细胞%溶解率。

　　l 血液学应用：造血干/祖细胞测定

　　造血干/祖细胞移植已广泛应用于血液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免疫缺陷病等，因此检测造血干/祖细胞已成为临床必不可少的手段。应用流式细胞仪多色技术测定外周血造血干/祖细胞，具有快速、准确的优点，不仅能确定造血细胞数量，而且能对造血干祖细胞的质量进行评价，为临床干细胞移植治疗提供重要数据。目前多色组合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。

　　CD34抗原是一种分子量约11万的糖蛋白，选择性地表达于早期造血干/祖细胞、小血管内皮细胞和胚胎纤维母细胞表面。该抗原在原始造血细胞上表达，以后随细胞分化、成熟逐渐减少直至消失，因此一直作为造血干/祖细胞表面的一种特征性标志而广泛应用于造血干细胞基础研究和临床。CD34+细胞是一群不均一的群体，依其是否表达CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亚群表现出了不同的造血性能。最近随着造血理论的深入研究关于造血干细胞究竟是否都是CD34+细胞出现一些争论,实验研究证明, CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞更具造血潜能,有人经实验研究提出CD34的表达与造血干细胞的细胞动力学相关,细胞激活时CD34+,细胞处于稳定状态时CD34-;也有人提出CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早。我们认为：成人体内可能仍保留着一小部分原始间充质细胞，他们仍保留着多向分化能力，也能向造血干细胞分化，因此体内有CD34-造血干细胞和CD34+造血干细胞是正常的，CD34-造血干细胞较CD34+造血干细胞发育阶段更早、更具造血潜能;但目前的用CD34+细胞代表造血干细胞的检查方法已足以满足临床需要，因为临床实践已证明这一点。理论研究往往能推动学术发展，开发新技术，我们期待着造血理论的不断发展给临床带来新技术，不断提高临床疗效。

　　我们用CD34、CD38、HLA-DR三色组合测定了151份外周血经动员后标本，CD34+细胞占单个核细胞(MNC)的(0.954±0.466)%，含量为(3.55±2.41)×109/L;其中CD34+CD38-亚群含量为(0.253±0.24)×109/L，占CD34+细胞的7.13%;CD34+HLA-DR-亚群含量为(0.273±0.310)×109/L，占CD34+细胞的7.61%;随着采集次数的增加，CD34+细胞及其亚群数量逐渐减少(P<0.05);随着供者年龄增加，其外周血CD34+细胞数逐渐减少，在≥40岁供者CD34+细胞百分比和含量比<20岁供者分别降低了47%和50%;动员后外周血CD34+细胞数存在性别差异，男性供者外周血CD34+细胞数较女性高23%。

　　应用流式细胞仪测定造血干细胞虽具有快速、准确的特点，目前被广泛采用。但应用中要特别重视质量控制，要建立一套完整质控方法以确保检测的准确性。

　　l 其他应用

　　流式细胞仪可能在两方面对骨髓增生异常综合症(MDS)有用，一是测定CD34阳性细胞数，以监测病情，二是测定核蛋白增殖因子(PCNA),有报告PCNA再在生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症、白血病三种疾病中表达有明显差异，可辅助鉴别诊断。

　　此外流式细胞仪也可检耐药蛋白,如肺耐药相关蛋白(LRP)、多药耐药蛋白(MRP)、 P170等。

　　流式细胞仪也可检测细胞因子，细胞内细胞因子如白介素系列(IL-1—IL-14),肿瘤坏死因子(TNF),干扰素(IFN)等,只要用适当的打孔剂即可用抗上述细胞因子单克隆抗体标记后用流式细胞仪测定。