第一节 聚合酶链反应
一、PCR(polymerase chain reaction,PCR)的基本原理
1、掌握PCR的定义及PCR的工作原理。PCR
技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain
Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和
赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环
的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。
2、掌握PCR反应的基本步骤。PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应。
二、PCR 引物设计
1、掌握PCR引物设计的原则。PCR
反应的特异性及成功与否将与引物设计的好坏直接相关，PCR引物的设计又是立足于模板序列，而模板序列必须是已知的。PCR作为一个体外酶促反应，其效率
和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。
2、掌握引物设计的方法。（1）手工设计：以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列。按5’→3’方向，照抄模板的序列，先写下5’端引物的序列；然后根据模板3’的序列，写下由5’→3’方向的互补链的碱基序列，即为3’引物的序列。（2）计算机软
件
设计引物：目前在Internet网上提供很多免费在线引物设计程序，根据PCR引物设计的基本原则，输入诸如模板序列、扩增区域、扩增子长度、引物长度
等限定参数时，便可得到有关引物最佳序列、引物起始碱基位置、引物的Tm值、引物GC%、引物的二级结构（如自身二聚体形成的发夹结构、引物间二聚体）、
模板和引物结合的热函、自由能等热力学参数。能提供PCR引物设计程序的网站有：http：//www.genome.wi.mit.edu等,
不同的程序都有自己的特色，但都能满足设计引物的基本需要。此外还可以与有些生物技术公司联系，购买商品化的引物设计软件。
三、模板的制备
了解PCR的模板的种类及制备方法。DNA和RNA均可作为PCR的模板。DNA可以直接作模板加入反应体系进行扩增，RNA的扩增需要逆转录为cDNA后才能进行PCR扩增，故又称这种扩增方式为RT-PCR。
核酸模板的取材主要依据PCR的扩增对象，常见的病原体标本有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。病理生理标本有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。还可从考古样品制备核酸模板。
四、PCR技术的特点
了解PCR技术的特点。检
验PCR扩增效率的指标为特异性、高效性和忠实性。PCR技术有如下特点：（1）操作简便；（2）省时；（3）灵敏度高；（4）特异性强；（5）模板材料
易获得；（6）有一程度的单核苷酸错误掺入；（7）TagDNA聚合酶催化的PCR扩增终产物3’端加尾，这种多出来的“毛边”碱基几乎总是A；
（8）PCR反应过程遵循酶促动力学规律。
五、PCR基本反应及反应条件的控制
熟悉PCR的基本反应及了解PCR反应条件的优化。
PCR的基本反应包括以DNA为模板的反应和以mRNA为模板的反应。
PCR反应条件的优化包括控制引物浓度、调整缓冲液浓度及pH值、控制Mg2+离子和dNTP浓度、采用合适的耐热DNA聚合酶、设置合理的循环参数和循环数等。
六、PCR实验中应注意的事项
了解PCR实验中应注意的事项。由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品污染便有可能导致假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。
七、PCR技术的主要类型
了解PCR技术的主要类型及其应用。
PCR技术的主要类型有1、筑巢PCR；2、共享引物PCR；3、多重PCR； 4、不对称PCR；5、锚定PCR；6、反向PCR；7、彩色PCR；8、原位PCR；9、定量PCR；10、差异显示PCR；11、重组PCR等。
这些技术具其较高的实用性而在各个领域广泛使用。
八、PCR 技术的应用
了解PCR技术在医学及分子生物学中的应用。PCR技术广泛的应用于遗传性疾病的诊断，传染病病原体的检测、法医学，考古学和分子生物学的各个领域。
