预处理及固液分离

　　预处理及固液分离

　　第一节 发酵液(培养液)的预处理

　　预处理的目的

　　? 改变发酵液(培养液)的物理性质，以利于固液分离。主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。

　　? 去除发酵液(培养液)中部分杂质以利于后续各步操作。

　　预处理的方法

　　一、加热

　　加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液(培养液)加热到所需温度并保温适当时间。加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液(培养液)的粘度，使固液分离变得容易。但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。

　　预处理的方法

　　二、凝聚和絮凝

　　凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞(分泌胞外产物)、细胞的(分泌胞内产物)碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液(或培养液)，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。

　　1.凝聚

　　凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。

　　凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷(如细胞或菌体一般带负电荷)，因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有：Al2(SO4)3?18H2O(明矾)、AlCl3?6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等;常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。

　　2.絮凝

　　絮凝是指使用絮凝剂(通常是天然或合成的大分子量聚电解质)，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。

　　常用的絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、、聚丙烯酸钠和聚苯乙烯磺酸。

　　影响絮凝效果的因素很多，主要是絮凝剂的分子量，絮凝剂用量，溶液pH，搅拌速度和时间等。

　　三、使用惰性助滤剂

　　工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂

　　助滤剂的使用方法有两种：①在过滤前先在过滤介质表面预涂(铺)一层助滤剂。②助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。

　　常用的惰性助滤剂有硅藻土、珍珠岩、混合助滤剂(硅藻土或珍珠岩与石棉)、纤维素和活性炭。

　　助滤剂的选择要点如下：

　　(1)粒度选择

　　(2)根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的品种

　　(3)用量选择

　　四、去除杂蛋白质的其它方法

　　1.等电点沉淀

　　蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。

　　2.变性沉淀

　　使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂(丙酮、乙醇等)、加重金属离子如Ag+ 、Cu2+ 、Pb2+ 等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。

　　3.吸附

　　在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。

　　预处理的方法

　　五、不溶性多糖的去除

　　当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难，可用酶将它转化为单糖以提高过滤速度。例如在蛋白酶发酵液加α-淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速。

　　预处理的方法

　　六、高价金属离子的去除

　　对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2+、Mg2+、Fe3+等高价金属离子，预处理中应将它们除去。

　　? 去除钙离子，常采用草酸钠或草酸。

　　? 镁离子的去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去。

　　? 除去铁离子，可采用黄血盐，形成普鲁士兰沉淀：

　　作业：

　　? 改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些?其简要机理如何?

　　? 除去发酵液杂蛋白的常用方法有哪些?

　　第二节 细胞破碎

　　一、概念

　　破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放。

　　二、影响细胞破碎的因素

　　1、细胞壁的结构

　　2、破碎方法

　　细胞壁的结构

　　? 细菌

　　革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层(约20-80nm)组成 ，而革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅2-3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约8-10nm，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎。

　　? 霉菌

　　霉菌的细胞壁较厚，约100-250nm。

　　? 酵母菌

　　酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。

　　破碎方法

　　? 机械法

　　高压匀浆法

　　高速珠磨法

　　超声波破碎法

　　? 非机械法

　　化学法

　　酶解法

　　物理法：渗透压冲击法、冻融法

　　干燥法

　　1、非机械法

　　A、高压匀浆法

　　适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。

　　B、高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。

　　C、超声波破碎法：实验室常用

　　影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。

　　2、非机械法

　　A、化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分

　　B、酶解法

　　利用酶(溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等)反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的。需与其它方法配合使用(辐射、渗透压冲击、反复冻融法等)

　　? 途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用

　　? 自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶

　　? 自溶的方法：

　　加热法、干燥法

　　C、渗透压冲击法

　　先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。

　　D、冻结-融化法

　　将细胞放在低温(-150C)，然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。

　　E、干燥法

　　经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。

　　方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥

　　三、破碎率的评价

　　细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：

　　Y(%)=[(N0-N)/N0]×100

　　N0-原始细胞数量

　　N-经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量

　　目前N0和N主要通过下面的方法获得 ：

　　? 直接计数法

　　在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。

　　? 间接计数法

　　间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体(完整细胞和碎片)，然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。

　　四、各种破碎方法的评述

　　? 高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。

　　? 非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结-融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性.

　　五、破碎方法的选择依据

　　?处理量

　　高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产

　　?产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性以及产物在细胞中的位置

　　生化物质的稳定性

　　?细胞的数量和细胞壁的强度

　　?破碎程度

　　?提取分离的难易

　　总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。

　　第三节 固液分离

　　? 固液分离：是指将发酵液(或培养液)中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。

　　一、固液分离设备

　　? 过滤设备

　　板框压滤机

　　真空鼓式过滤机

　　? 离心设备

　　过滤式离心机

　　沉降式离心机

　　1、过滤设备

　　? 板框过滤机

　　原理

　　特点 板框压滤机的过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长(包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等)。

　　适用对象 广泛应用与培养基制备的过滤及霉菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种发酵液的过滤 。

　　2、离心设备

　　? 过滤式离心机

　　转鼓上开有小孔，转鼓内表面覆盖过滤介质，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出，固体被截留在过滤介质表面。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量高的场合。

　　? 沉降式离心机

　　转鼓上无小孔，不需要过滤介质，在离心力的作用下，固体沉降于鼓壁上，余下的即为澄清的液体。适用于固体量较低(小于10%)的场合。常用的沉降式离心机有碟式离心机和管式离心机。

　　二、过滤方式

　　? 常规过滤

　　料液流动方向与过滤介质(能使固液混合料液得以分离的某一介面)垂直。

　　? 错流过滤

　　料液流向平行于过滤介质。过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。

　　三、影响固液分离的因素

　　? 微生物种类

　　真菌的菌体大，固液分离容易，可采用鼓式真空过滤或板框过滤;细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要采用一些手段增大粒子。

　　? 发酵液黏度

　　固液分离速度与黏度成反比

　　? 其它因素

　　发酵液的PH值、温度和加热时间

　　四、固液分离的发展动向

　　改善固液分离的手段主要从下列三方面进行：

　　? 利用错流过滤

　　? 利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状

　　? 采用双水相萃取处理细胞匀浆液