电泳技术
一、基本概念
目前电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。
何谓电泳?在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象，称为电泳。
二、影响泳动率的因素
1.电泳介质pH值的影响
对于蛋白质和氨基酸等两性分子，电泳介质的pH值决定了它们所带净电荷性质和多少。pH值小于等电点，分子带正电荷，向负极泳动，如果pH大于等电点，分子带负电荷，向正极泳动。pH值偏离等电点越远，分子所带净电荷越多，其泳动速度越快。当缓冲液pH值等于其等电点时，分子处于等电状态，不移动。由于血清蛋白质的等电点多在pH4-6之间，因此，分离血清蛋白常用pH8.6的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。
2.缓冲液的离子强度
离子强度是表示溶液中电荷数量的一种量度。离子强度等于溶液中各种离子的摩尔浓度与其价数平方之积总和的一半
溶液中的离子浓度越大、或离子的价数越高，离子强度就越大。对缓冲液来说，离子强度过低主要是影响缓冲液的缓冲容量，不易维持介质pH的恒定;离子强度过高，带电粒子的电泳速度减慢。这是由于带电的生物大分子吸附溶液中的反电荷离子(图1-20)形成反离子氛，犹如大气层包围地球。距离中心离子愈近，反离子密度愈大;反之，密度愈小。根据反离子与中心离子结合的紧密程度不同，可将反离子层分为吸附层和扩散层。在电场的作用下，吸附层的反离子随中心离子一起泳动。离子强度越大，吸附层反离子越多，泳动粒子团的净电荷越少，泳动速度也就越慢。
3.电渗
在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。电渗是由于支持物带有电荷所引起的。支持物上的电荷使介质中的水感应产生相反电荷。如纸上电泳所用的滤纸纤维素带有负电荷;琼脂电泳中，所用的琼脂由于大量硫酸根的存在也带有负电荷，它们使水感应产生水合氢离子(H+3O)。在外电场的作用下，水向负极移动。如果被测定样品也带正电荷，则移动更快;如果被测定样品带负电荷，则移动减慢。所以电泳时，颗粒泳动所表现的速度决定于颗粒本身的泳动速度和溶液的电渗作用。因此在选用支持物时，应尽量避免高电渗作用的物质。
4.电场强度的影响
电场强度增高，带电粒子受到的电场力增大，泳动速度加快，但泳动率不变。
随着电场强度的增高，电流强度增加，产热也增多。产热的不良后果是：(1)引起水的蒸发，改变溶液pH
及离子强度;(2)引起介质温度高，可使蛋白质变性。因此电泳必需控制电压在一定范围之内，当进行高压电泳时，必需装备有效的冷却装置。
三、电泳技术的种类
电泳技术的种类很多。根据有无固体支持物，可分为两大类，即界面电泳和区带电泳。界面电泳是指在溶液中进行的电泳，没有固体支持物。当溶液中有几种带电粒子时，通电后由于不同种类粒子泳动速度不同，在溶液中形成相应的区带界面，但区带界面由于扩散而易于互相重叠，不易得到纯品，且分离后不易收集，故目前已很少应用界面电泳。区带电泳是指在支持物上进行的电泳。支持物将溶液包绕在其网孔中，防止溶液自由移动。通电后各种带电粒子可以形成许多清晰的区带。故区带电泳的分离效果远比界面电泳的好。根据支持物的不同，常用的区带电泳又可分为纸上电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳等。
(一)醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术，和纸上电泳相似并且在其基础上发展起来的，该电泳技术具有比纸电泳电渗小，分离速度快、样品用量小、而分辨率高、分离清晰等优点。
(二)琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖(agarose)是经过挑选，以质地较纯的琼脂(agar)作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖，它由D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列织成(图1-21)。
琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大(98～99%)，近似自由电
泳，固体支持物的影响较少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。
(三)聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品最小(1～100
μg)、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例，聚合成不同孔径大小的凝胶，可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。还可结合解离剂十二烷基硫酸钠(SDS)，以测定蛋白质亚基的相对分子质量。
根据凝胶支柱形状不一，可分为盘状电泳和垂直板型电泳。盘状电泳是在直立的玻璃管内利用不连续的缓冲溶液、pH和凝胶孔径进行的电泳。垂直板型电泳是将聚丙烯胺凝胶聚合成方形或长方形薄片状，薄片可大可小。其优点是：
(1)在同一条件下可同时做多个要比较的样品;
(2)一个样品在第一次电泳后可将薄片转90度进行第二次电泳，即双向电泳，这样可提高分辨力;
(3)便于电泳后进行放射自显影的分析。
其缺点是制备凝胶时较盘状电泳复杂，所需电压较高，电泳时间长。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳由于同时兼有电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，因此具有很高的分辨率。其分子筛效应主要由凝胶孔径大小决定，而决定凝胶孔径的大小主要是凝胶的浓度，例如
7.5%的凝胶孔径平均为50A，30%的为20A左右。但交联剂对电泳泳动率亦有影响，交联剂重量对总单体重量的百分比愈大，则电泳泳动率愈小。不管交联剂是以何种方式影响电泳时的泳动率，总之它是影响凝胶孔径很重要的一个参数。为了使试验的重复性较高，在制备凝胶时对交联剂的浓度、交联剂与丙烯酰胺的比例、催化剂的浓度、聚胶所需时间等影响泳动率的因子都应尽可能保持恒定。
(四)高效毛细管电泳
1.基本原理
高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoress，
HPCE)和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。在熔融石英毛细管内壁覆盖一层硅氧基(Si-O)阴离子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双电层。层外缘扩散层中富集的阳离子被电汤阴极吸引导致溶液向阴极的流动，这种效应称为电渗(electroosmosis)。电渗流的速度ueo和电场强度E成正比，定义电渗速度μeo。和场强E的比值为电渗淌度μeo，即
μeo=μeo/E
电渗淌度与硅氧层表面的电荷密度成正比，与离子强度的平方根成反比。在低pH条件下，硅氧层形成分子(Si-OH)，因而减少了表面电荷密度，故电渗速度减小。如在pH=9的绷砂缓冲液中电渗速度约2mm/s
，而在pH=3介质中电渗速度减小约一个数量级。影响电渗的一个重要因素是毛细管中因电流作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度高于边缘的温度，形成抛物线型的温度梯度，管壁附近温度低，中心温度高，结果使电渗速度不均匀而造成区带变宽，柱效降低。为此，应避免使用过长和内径大于50μm
的毛细管柱，还应注意减小毛细管的壁厚、选择适宜的电压和缓冲液及使用良好的冷却系统。
HPCE 中观察到的离子淌度是离子的电泳淌度μe和溶液的电渗淌度的加和。定义表观淌度为μapp，则
μapp=μep +μeo
根据以上的讨论，带正电荷的离子的μep>0，μeo>0，故μapp总是为正号，离子向阴极移动;而带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥，μep<0，在高pH条件下，若μeo>μep，μapp仍为正号，离子仍然可向阴极移动，但在低pH条件下，μapp可为负号，离子将向反方向移动。此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析的离子。
对于实际速度为μnet (net 指 net speed)的组分，表现淌度可由下式计算：
Ld /t
μapp=μnet/E =
V /Lt
式中Ld：从进样口到检测器的实际柱长;Lt ：总柱长;V：电压;t：所需的分析时间。
实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时μep=0, μeo=μapp, μep=μeo上式为：
Ld /t
μeo =μ中性/E =
V /Lt
HPCE的毛细管容易冷却，故可以使用20～30
kV的高电压，由于管内径只有25～100μm，无涡流扩散，使传质阻抗趋于零，因此，有很高的分辨率。电解质液由毛细管阳极端进入毛细管，携带被分离的组分可以从毛细管阴极端流入检测器的比色池，电泳过程与结果分析均容易自动化。因此HPCE已成为效率极高的现代分析仪器，在生物化学与分子生物学中得到日益广泛的应用。
2.类型及应用
(1)毛细管区带电泳
毛细管区带电泳法(capillary zone elctrophoresis
，CZE)的分离基于组分淌度的区别，一般毛细管内壁带负电荷。电渗流从阳极移动至阴极，流出顺序是阴离子<中性分子<阳离子。若毛细管内壁涂上一层阳离子表面吸附剂，则极性颠倒，流出顺序是阳离子<中性分子<阴离子。
毛细管区带电泳具有分离方便、快速、样品用量小的特点，在无机离子、有机物、氨基酸、蛋白质及各种生物样品的测试中有着广泛的应用。
(2)胶束电动毛细管色谱
CZE主要用于分析带电荷的离子，对中性分子的测试主要是依靠电渗的作用，分离比较困难。此时可应用胶束电动毛细管色谱(micellar
electrokinetic capillary chromatography ,MECC)进行分离分析。
MECC是在缓冲溶液中加人表面活性剂，当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，则形成荷电胶束。而当无胶束存在时，所有中性分子将同时到达检测测器，有胶束时带负电荷的胶束在电场作用下向相反方向泳动，溶质分子在胶束和水相间形成平衡，在溶液的电渗流和胶束的电泳流的共同作用下分离。溶质分子在胶束内停留时间越长，其迁移所需时间即保留时间越长。
最常用的表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。各种阴阳离子表面活性剂和环糊精等添加剂使得本法有相当多的选择余地，可广泛用于各种类型的样品，在手性分离中也有成功的应用。
(3)毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,
CGE)是在毛细管中填充具线状缠结聚合物结构的物理凝胶，使样品中各组分通过净电荷差异和分子大小差异双重机制得以分离。CGE在蛋白质、多肽、DNA
序列分析中得到成功应用，已成为生命科学基础和应用研究中有力的分析工具。
近年来，其他类型的毛细管电色谱法(capillary electro-chromatography,
CEC)发展很快。其中填充毛细管电色谱法(packed colomn, CEC)是将细粒径固定相填充在毛细管柱中，开管毛细管电色谱法(Open tubular,
CEC)是把固定相的官能团键合在毛细管内壁表面而形成的色谱柱。CEC是很有前途的分析方法。
