高效液相色谱仪理论常识

　　被分离组分在柱中的洗脱原理

　　Ⅱ 基本概念和理论

　　一、基本概念和术语

　　1.色谱图和峰参数

　　⊕色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile).

　　⊕基线(base line)--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

　　⊕噪音(noise)――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

　　⊕漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

　　⊕色谱峰(peak)--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。

　　⊕拖尾因子(tailing factor,T)--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。

　　⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。

　　⊕峰高(Peak height,h)――峰的最高点至峰底的距离。

　　⊕峰宽(peak width,W)--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。

　　⊕半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)--峰高一半处的峰宽。W h/2=2.355σ。

　　⊕标准偏差(standard deviation, σ)--正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ 小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之，σ大，峰形胖、柱效低。

　　⊕峰面积(peak area,A)――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h

　　2.定性参数(保留值)

　　⊕死时间(dead time,t0)--不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

　　⊕死体积(dead volume,V0)――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据，Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。 V0=F×t0(F为流速)

　　⊕保留时间(retention time,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

　　⊕保留体积(retention volume,VR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F*tR .

　　⊕调整保留时间(adjusted retention time,tR’)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件(温度、固定相等)一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0

　　⊕调整保留体积(adjusted retention volume,VR’)--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’

　　3.柱效参数

　　⊕理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。

　　N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：

　　N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2

　　W：峰宽 ; σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。

　　N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

　　用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

　　N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

　　若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)2

　　⊕理论塔板高度(theortical plate height,H)每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H=L/N

　　4.相平衡参数(distribution coefficient,K)--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K=[xs]/[xm]

　　Cs-溶质在固定相中的浓度

　　Cm-溶剂在流动相中的浓度

　　分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为滲透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

　　在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs 、Cm很小)时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰;在许多情况下，随着浓度的增大，K减少，这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能较少进样量，使组份在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

　　在同一色谱条件下，样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱;K值小的组份则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组份的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。

　　在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及PH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

　　⊕容量因子(capacity factor,K)--化合物在两相间达到平衡时，在固定相与流动相中的量之比。K=(tR-t0)/t0=tR’/t0(或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量)。因此，容量因子也称质量分配系数。

　　{K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs：色谱柱中固定相的体积; Vm：色谱柱中流动相的体积。｝

　　分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k===K=,tR’=kt0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组份在固定相中停留的时间(tR’)是不保留组分保留时间(t0)的几倍。k=0时，化合物全部存在与流动相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。

　　容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关;k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR’、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

　　⊕选择性因子(selectivity factor,α)--相邻两组份的分配系数或容量因子之比。α==(设k2>k1)。因k=tR’/t0,则α=k2/k1，所以α又称为相对保留时间(《美国药典》)。

　　要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

　　5.分离参数

　　⊕分离度(resolution,R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=(tR2-tR1)/[(W1+W2)/2],当W1=W2时，R=。当R=1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露锋面积为95.4%，内测峰基重叠约2%。R=1.5时，称为6σ分离，裸露锋面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。

　　⊕基本分离方程――分离度与三个色谱基本参数有如下关系：

　　R=1/4(а-1)×N0.5×[k’/(1+k’)]

　　其中N称为柱效项，α为柱选择项，k’为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。

　　从基本分离方常可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α=1时，R=0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及PH值;b.改变柱温;c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。 k2趋于0时，R也趋于0;k2增大，R也增大。但k2 不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2 在1～10范围内，最好为2～5，窄径柱可更小些。

　　二、塔板理论

　　1.塔板理论的基本假设

　　塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：

　　1)色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔(即塔板高度)内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。

　　2)样品加在第0号塔 板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。

　　3)流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔 板体积。

　　4)在所有塔 板上分配系数相等，与组分的量无关。

　　虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡;组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。

　　2.色谱流出曲线方程及定量参数(峰高h和峰面积A)

　　根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述;

　　C=e 或 C=e

　　由色谱流出曲线方程可知;当t=tR时，浓度C有极大值，Cmax=.Cmax就是色谱峰的峰高。因此上式说明;① 当实验条件一定时(即σ一定)，峰高h与组分的量C0(进样量)成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。

　　②当进样量一定时，σ越小(柱效越高)，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。

　　由曲线方程对V(0～∞)求积分，即得出色谱峰面积A=×σ×Cmax =C0。可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。把Cmax=h和Wh/2=2.355σ代入上式，即得A=1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。

　　三、速率理论(又称随机模型理论)

　　1.液相色谱速率方程

　　1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板理论高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论――速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽(即柱效)的影响。

　　后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程(H=A+B/u+Cu,后称气相色谱速率方程)的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程(即Giddings方程)：

　　H=2λdp++\s\up5(2p+\s\up 5(2p+\s\up 5(2f

　　2.影响柱效的因素

　　1)涡流扩散(eddy diffusion).由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3～10 um，最好3～5um，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小难于填充均匀(λ大)，且会使柱压过高。大而均匀(球形或近球形)的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用而均匀的载体，这种有助于提高柱效。毛细管无填料，A=0。

　　2)分子扩散(molecular diffusion).又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2rDm/u.u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长(u小)，展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm 很小，通常仅为气相的10-4～10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。r一般在0.6～0.7左右，毛细管柱的r=1。

　　3)传质阻抗(mass transfer resistance)。由于溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。

　　①流动相传质阻抗Hm=Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中硫路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相迁移，因而产生峰展宽。

　　②静态流动相传质阻抗Hsmd2pu/Dm,Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。

　　Hsm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应采用低力度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。

　　③固定相传质阻抗Hs=Csd2fu/Ds(液液分配色谱)，Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df 的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。

　　从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt,在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小(大约0.03～0.1mm/s)在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。

　　3.柱外效应、

　　速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应(色谱峰在柱外死空间里的扩展效应)。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，

　　即：σ2=σ2柱内+σ2柱外+σ2器它

　　柱外效应主要有低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜成流线型，检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应< 。其次，希望将样品直接进在柱头的中心部位，但是由于进样阀与柱间有接头，柱外效应总是存在的。此外，要求进样体积≤VR>

　　柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分(如k<2)峰形拖尾和峰宽增加得更为明显;k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高(N越大)，柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。

　　Ⅲ HPLC系统

　　HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

　　最早的液相色谱仪有粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长之可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。

　　目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters 公司、Agilent 公司(原HP公司)、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。

　　一、输液泵

　　1.泵的构造和性能

　　输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。砂的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应〈0.5%，这结定性定量的准确性纛关重要;②流量范围宽，分析型应在0.1～10ML/MIN范围内连续调，制备型应能达到 100ML/MIN;③输出压力高，一般应能达到150～300KG/CM2：④液缸容积小;⑤密封性能好，耐腐蚀。

　　泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。恒压泵受柱阴影响，流量不稳定;螺旋泵缸体太大，这两种泵己被淘汰目前应用最多的是柱塞往复泵。

　　柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ML，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱;改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阴影响;泵压可达400KG/CM2。ADW主要缺点是输出的脉冲性较大，现多彩采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好(RSD为0.1%左右，串联泵为0.2～0.3%)，但出现故障的机会较多(因多一单向阀)，价格也较贵。

　　项目 Waters515型 HP1100型 LC-10Atvp型 Elite P200 Ⅱ型 检定要求

　　流速范围 0.001～10 0.001～10 0.001～9.999 0.01～4.99

　　调节精度 0.001 0.001 0.001 0.01

　　流量精密度 RSD0.1% 0.15%(〈0.3%〉 0.3% 0.5% 1.5%

　　流量准确度 ±2.0% ±5.0% ±2.0%

　　最高压力 4000Psi 40MPa 39.2MPa 40.0MPa

　　密封圈寿命

　　流动相的脉冲

　　2.泵的使用和维护注意事项

　　为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：

　　①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸镏，而常用的方法是滤过，可采用MILLIPOIPORE滤膜(0.2或0.45)等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

　　②流动相不应含有任何腐性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至兴是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱术保存和有利于泵维护的溶剂(对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇水)。

　　③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。

　　④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

　　⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

　　如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障

　　①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量下运转，将气泡排尽，也可用一个50ML针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。

　　②压力和流量不稳。原因可能是气泡，须要排除;或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，进入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这是，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将纱滤棒浸入稀酸内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。

　　③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

　　3.梯度洗脱

　　HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和PH值等，用于分析组分数目多、性质差异罚大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。

　　梯度洗脱有两种方式：低压梯度(外梯度)和高压梯度(内梯度)。

　　两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。

　　在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：

　　①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相，有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

　　②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱沧剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

　　③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘主度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 ④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始流动相泫经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

　　二、进样器

　　早期使用隔膜和停流进们器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLCfj样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

　　1.隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用(如10MPA以上);此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1～2%;加之能碉各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。

　　2.停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”;另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。

　　3.阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀(以美国RHEODYNE公司的7725和7725I型最常见)，其关键部件由圆形密封垫子(转子)和固定底座(定子)组成。由于阀接头和连接管死体积在存在，柱效率低于隔膜进样(约下降5～10%左右)，但耐高压(35～40MPA)，进样量准确，重复性好(0.5%)，操作方便。

　　六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%(最多 75%)，并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5～10倍9最少3倍)，这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。

　　六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45UM滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力;转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样吕残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

　　4.自动进样。用于大量样品的常规分析。

　　三、色谱柱

　　色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10UM等，柱效理论值可达5～16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析，只要500即可;对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

　　柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，不要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

　　1.柱的构造

　　色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于 70KG/CM2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效京，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径 0.2-20um(5-10 um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出.

　　色谱柱按用途分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:①常规分析柱(常量柱),内径2-5mm(常量4.6mm, 国内又4mm和5mm),柱长10～30CM;②窄径柱(NARROWBORE，又称细管径柱、半微柱SEMI-MICROCOLUMN)，内径 1～2MM，柱长10～20CM;③毛细管柱(又称微柱MICROCOLUMN)，内径0.2～0.5MM;④半制备柱，内径>5MM;⑤实验室制备柱，内径20～40MM，柱长10～30CM;⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

　　2.柱的发展方向

　　因强调分析速度而发展出短柱，柱长3～10CM，填料粒径2～3UM。为提高分析灵敏度，与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2MM的微径柱(MICROBORE)。细管径柱的优点是：①节省流动相;②灵敏度增加;③样品量少;④能使用长柱达到高分离度;⑤容易控制柱温;⑥易于实现LC-MS联用。

　　但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)，更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1～100UL/MIHN的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度检测器，电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。

　　3.柱的填充和性能评价

　　色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度>20um 时，干法填充制备柱较为合适;颗粒<20um时，湿法填充较为理想。填充方法一般有四种：①高压匀浆法，多有用于分析柱和小规模制备柱的填充;②径向加压法，Waters 专利;③轴向加压法，主要用于装填大直径柱;④干法。柱填充的技术性强，大多数实验室使用己填充好的商品柱。

　　必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。

　　无论是自己装填的还是购买的色谱柱,使用前都应对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要生意重新检查.柱性能指标包括在一定实验条件下(样品,流动相,流速,温度)下的柱压,理论塔板高度和塔板数,对称因子,容量因子和选择性因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在或以骨。进行柱效比较时，不要注意柱外效应是不有变化。

　　一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长，内径，填料的种类，粒度，色谱柱的柱效，不对称度和柱压降等。

　　4.柱的使用和维护注意事项

　　色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效，缩短使用寿命甚至损坏.在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱.

　　①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动.温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时讹的转动不能过缓(如前所述).

　　②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然.

　　③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱关的杂质.否则反冲会迅速降低柱效.

　　④选择使用适宜的流动相(尤其是PH)，以避免固定相被破坏.有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解.

　　⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱骨需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱.保护柱一般是填有固定相的短柱.保护柱可以而且应该经常更换.

　　⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75ml。

　　下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：

　　正相硅胶柱以正已烷(或庚烷)`二氯甲烷(或氯仿)和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使　硅胶表面重新活化。

　　反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动　相不含缓冲液，那么可以省略最后一步用水冲洗。一氯甲烷能洗支残留的非极性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混全溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗能除去蛋白质污染。

　　阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇　、水依次冲洗。

　　⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

　　⑧色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。

　　在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁