奶品中三聚氰胺的常规检测和GCMS确证

上一篇 / 下一篇 2010-05-05 11:41:42

反相离子对色谱法测定奶粉中三聚氰胺含量，操作简便，检测快速； GCMS气质联用仪检测法具有灵敏度高、重现性好和可靠性高等优点，定量检测限可达5μg/kg，可以有效检测样品中所含的微量三聚氰胺

三聚氰胺（melamine）简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。三聚氰胺含氮量为66.6％，加入宠物饲料和牛奶中可以大幅提高蛋白质测定表观含量，但食用后可诱发肾衰竭并导致死亡。2007年，国内外发生多起宠物因食用添加了三聚氰胺的宠物食品而致死的例子，大量相关产品被召回。 2008年9月，国内发生奶粉中三聚氰胺导致婴幼儿肾结石和肾功能衰竭甚至死亡的恶性事件。

奶粉、奶制品中三聚氰胺的检测方法主要有HPLC紫外检测、GCMS和LC-MS/MS串级质谱检测。HPLC紫外检测样品处理简单，但检测限较高且易受干扰。LC-MS/MS串级质谱可以弥补HPLC液相紫外检测的缺点，但仪器成本高昂、操作复杂，不利于常规检测。GCMS检测具有灵敏度高、抗干扰性强、可靠性高等优点，缺点是样品必须进行硅烷化衍生后才能检测。

图1. 三聚氰胺硅烷化衍生物TIC图

图2. 三聚氰胺硅烷化衍生物质谱图。

本文参考农业部NY/T 1372-2007饲料中三聚氰胺测定方法中的样品提取纯化过程，介绍了两种检测方法，一是采用反相离子对色谱法测定奶粉中三聚氰胺含量，操作简便，灵敏度高；二是使用GCMS对奶粉和奶制品中三聚氰胺含量进行检测。

GCMS检测法

利用三氯乙酸超声萃取样品中三聚氰胺，经混合型阳离子交换柱固相萃取净化后进行硅烷化衍生，再由GCMS进行检测。方法重现性良好，RSD<2%，最低定量检测限为5μg/kg,在0.02~2μg/ml浓度范围具有良好的线性。

表1. 重现性考察数据

样品前处理

（1）超声萃取

称取5g样品，加入50ml三氯乙酸溶液和2ml乙酸铅溶液，超声萃取20min。取上层液30ml，高速离心5min。

（2）SPE净化

3ml甲醇、3ml水依次活化SPE柱，取10ml离心液上柱，再用3ml水、3ml甲醇洗涤SPE柱，用3ml 5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液氮气吹干，20%甲醇溶液定容至2ml。

（3）衍生化

取适量上述甲醇定容溶液，氮气吹干，加入200ul吡啶和200ul衍生化试剂（BSTFA＋1%TMCS），70℃反应30min。

配制三聚氰胺标准浓度系列，取适量作同步衍生。

图3. 三聚氰胺标准曲线。

仪器条件

岛津GCMS-QP2010 Plus气质联用仪；色谱柱：Rtx-5MS, 30m×0.25mmID×0.25um；柱温：100℃（1min）_10℃/min_210℃（3min）_50℃/min_300℃（2min）；柱流量：1.0 ml/min ；流速控制方式：恒线速度方式；进样口温度：250℃；进样方式：不分流（1min）；高压进样：250Kpa（1min）；离子源温度：230℃；接口温度：300℃；扫描质量范围：

60~400amu；定量采用SIM方式：定量离子为327.2，参考离子为171.1，342.2，99.1。

实验结果

（1）三聚氰胺标准溶液（0.1μg/ml）硅烷化衍生物扫描总离子流图及质谱图如图1、图2所示。

（2）配置6个浓度点标准溶液，浓度分别为：0.02，0.05，0.1，0.5，1.0和2.0μg/ml，经硅烷化反应后进样，得到标准曲线如下图3 所示，相关系数R = 0.99928。

（3）对0.1μg/ml浓度标样硅烷化衍生物平行进样5次，考察峰面积重现性，得到RSD为1.231%，重现性良好。数据如表1所示：

（4）在经检测不含三聚氰胺的空白奶粉中添加三聚氰胺标样考察回收率，添加浓度为0.4μg/ml，实际检测浓度为0.396μg/ml，回收率为 99%。检测数据如下：

（5）对0.02μg/ml标准溶液数据，通过GCMSsolution软件计算仪器定量检测限（10倍信噪比）为5μg/L。按上述样品前处理过程计算出奶粉和奶制品中三聚氰胺的定量检测限为5μg/kg。

（6）实际奶粉样品测试，取5g某品牌奶粉，按上述前处理方法制备样品，进样得到如下谱图，此样品中检出三聚氰胺，浓度为1.473mg/kg。

结论

使用GCMS气质联用仪检测奶粉和奶制品中三聚氰胺含量具有灵敏度高、重现性好和可靠性高等优点。本方法中仪器在0.02~2μg/ml浓度范围内线性良好，定量检测限可达5μg/kg，可以有效检测样品中所含的微量三聚氰胺。

反相离子对色谱法

采用C8反相色谱柱，以缓冲液-乙腈（70:30，pH=3.0）为流动相，检测波长235nm，流速1ml/min，柱温40℃。结果表明，该方法保留时间在11min左右，精密度、线性关系均较好，检测限低。本方法对仪器要求低，使用等度系统和紫外可见检测器即可，适合于乳品相关企业用来作为三聚氰胺的检测方法。

图1(反相). 三聚氰胺标样图谱。

仪器、试剂与材料

仪器：本实验使用Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪系统，含LC-20AD输液泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-20A紫外可见检测器，CBM- 20A控制器，DGU-20A3在线脱气机。另外，还使用到如下设备：高速离心机（转速可达到10000r/min以上）、漩涡混合器、超声波清洗器、氮吹仪（控温60℃以上）、固相萃取装置、震荡摇床。

图2(反相). 5μg/ml标样连续5针进样重叠图谱。

试剂：甲醇，色谱纯：乙腈，色谱纯：氨水，浓度25%~28%；混合性阳离子交换固相萃取柱，60mg，3ml；三氯乙酸溶液10g/L，称取10g三氯乙酸加水至1000ml；氨水甲醇溶液，量取5ml氨水，溶解于100ml甲醇中；乙酸铅溶液22g/L，取22g乙酸铅用约300ml水溶解后定容至 1L；乙腈溶液，75ml乙腈加入25ml纯水，混匀；缓冲液，配制含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液，调节pH值到3.0；三聚氰胺标准品（纯度＞99%）。

流动相：将缓冲液与甲醇按照7:3比例混合，用0.45μm的滤膜过滤后备用。

三聚氰胺标准储备液：称取50mg（精确到0.1mg）的三聚氰胺标准品，用乙腈溶液溶解并定容于100ml容量瓶中，该溶液浓度为0.5mg/ml，于 4℃冰箱内贮存，有效期3个月。

图3(反相). 校准曲线。

三聚氰胺标准工作液：分别吸取适量标准储备液，用缓冲液稀释成浓度为0.5μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、50μg/ml、100μg /ml的标准工作液。于4℃冰箱内贮存，有效期1周。

样品前处理

（1）提取

奶粉样品取样5g，准确加入50ml三氯乙酸溶液，加入2ml乙酸铅溶液摇匀，超声提取20min，转入离心管，在10000r/min离心机上离心 5min，取上清液。

图4(反相). 空白奶粉。

（2）净化

分别用3ml甲醇，3ml水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，取上清液分次上柱，控制过柱速度在1ml/min以内。再用3ml水和3ml甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽近干后用氨水甲醇溶液3ml洗脱。洗脱液50℃氮气吹干，准确加入缓冲液，漩涡振荡1min，0.45um滤膜过滤，上机测定。

表1(反相). 保留时间与峰面积的重现性（方法精密度验证）

色谱分离条件

本实验所用色谱柱为GL Sciences C8 4.6×250mm 5um；检测波长设定为235nm；流速1ml/min；柱温 40℃；进样量为10μl；等度洗脱。

表2(反相). 3个不同浓度样品回收率

流动相配制方法如下：首先配制含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液，调节pH值到3.0。将缓冲液与甲醇按照7:3比例混合，用0.45μm的滤膜过滤后备用。

实验过程与结果

三聚氰胺标准贮备液（1mg/ml）：准确称量100.6mg三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中，用流动相溶解并准确定容至刻度，并用0.45μm的滤膜过滤，备用。

图5(反相). 空白奶粉加入0.5mg/kg三聚氰胺。

（1）保留时间与峰形

图1为本方法检测三聚氰胺标样的典型色谱图（样品浓度为1μg/ml），由图1可见，本方法所测三聚氰胺保留时间为11.02min，峰形尖锐，对称性好。

（2）标样精密度

取浓度为5μg/ml三聚氰胺标样，连续进样5次，结果如表1所示，由表1结果可见，本方法测定三聚氰胺具有很好的精密度和重现性。5针图谱如图2所示。

（3）线性关系

取标准工作液分别进样，得到校准曲线如图3所示，相关系数为0.9999，线性度良好。

（4）加样回收率

取奶粉空白样品，分别加入适量三聚氰胺标准工作液，使其三聚氰胺终浓度分别为0.5mg/kg，5mg/kg和50mg/kg，另外取阳性样品一个，共一个空白和四个样品。空白称量一份，每个样品各称量两份，总共9份，按照样品前处理方法进行提取纯化。结果如图4、5、6、7所示。

图6(反相). 空白奶粉加入5mg/kg三聚氰胺。

从图中看出，空白奶粉也检测出少量三聚氰胺。由于本次实验时间限制，无法挑选到一个合格的空白奶粉。这是可以改进的地方。

表3(反相). 保留时间与峰面积的重现性

计算3个不同浓度样品回收率如表2所示。

由表2可见，本方法检测三聚氰胺回收率一般。这是由于实验条件限制，无法对50ml以上液体进行一次性离心，因此称取的样品量和加入的试剂量均为标准提取方法的十分之一，即称取0.5g奶粉，加入5ml三氯乙酸溶液和0.2ml乙酸铅溶液。氮吹仪吹干后，加入0.5ml缓冲液溶解。如果实验条件改进，回收率能有很大改进。