微生物蛋白质组学的定量分析

　　在基因组研究的热潮下,蛋白质组学正在蓬勃发展,其分析着重于阐明生物体某一组织或某一细胞在某一时间点上基因表达的水平.在基因组已经确定的前提下如何分析不同时刻之间各种蛋白质表达的相对丰度是蛋白组表达分析的主要问题.蛋白质组研究也以微生物作为试验材料.微生物蛋白质组定量是试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别,主要有体外标记的电泳定量法,体内标记的电泳定量法,体外标记的色谱定量法及体内标记的色谱定量法四种方法.

　　一 体外标记的电泳定量法

　　这种定量法一般采用不同的蛋白质显色剂,将电泳分离的蛋白质染成可被肉眼识别的斑点,然后用图像分析软件比较斑点的吸光度差别.它的主要方法是直接比较法,荧光双向差异凝胶电泳法和免疫测定法.

　　直接比较法所用的双向电泳能直观地反映蛋白质表达的差 异,目前所公认的理想染色方法是荧光染色;但平行试验和胶图的匹配使样品的差异比较较为麻烦.将待比较的样品经不同染料标记后混合进行电泳的荧光双向电泳法,可在同一胶图上得到差异点,以解决直接比较法的问题.而在能找到广普性识别的抗体时,利用成熟的免疫化学特点定量分析蛋白质技术的免疫测定法就可 被使用.

　　二 体内标记的电泳定量法

　　这种定量法一般采用不同的同位素标记物,直接将其加入到微生物的培养液中, 参与细胞的蛋白质合成.电泳之后,分离的蛋白质用放射自显影方法检测并加以定量分析.主要有单种同位素标记法及差异凝胶曝光法.

　　单种同位素标记法中最常用的是将35S甲硫氨酸掺入蛋白质合成中的方法,但由于放射性自显影定量分析的误差较大,不同蛋白质合成过程中甲硫氨酸掺入程度不同及高放射性和高费用的原因,试验的操作性大打折扣.差异凝胶曝光法有上张的荧光双向差异凝胶电泳法相似的思路,使用不同蛋白质不同同位素处理的方法,测定不同样品中相同蛋白质的两种同位素的比例,来定量比较蛋白质组,有很高的灵敏度.

　　三 体外标记的色谱定量法

　　色谱定量法的核心技术在于单位时间内色谱峰的质谱分析.但电子喷雾过程对粒子化的抑制作用,造成了质谱信号与蛋白质浓度之间的非线性关系.因此,设定稳定的参照物成了质谱定量的关键问题.参照物的设定可以用两种方法.a.设定一个稳定的质谱参照物,所有质谱峰的强度都与之比较,但这难以做到.b.每一个质谱峰都设有各自的参照物.以肽段为例,一部分用同位素标记,因而可以被质谱仪检测到.肽段的体外标记目前有3种方法:半胱氨酸修饰法,羧基修饰法和氨基修饰法.

　　四.体内标记的色谱定量法

　　对于观察环境对细胞生长的影响,体内标记法是体外标记所法取代的,现在的体内标记的色谱法也多用同位素标记的方法.掺入所有的氨基酸的14N和15N是应用较多的同位素,但N掺入是一个随机的过程,肽段的质量转移是难以预测的,这也是其不能广泛应用的原因.