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【恐龙原创】一个样品含量分析的仲裁

上一篇 / 下一篇 2008-03-23 20:31:47

上星期五，一个公司送来一个样品，进行第三方检测，解决他们与客户之间的争端，介绍如下：
一样品，结构复杂，是三个环的酯类，结构暂时省略。
A 客户检测方：
国产色谱工作站，面积归一化含量88.3%，外标法69%。（仪器未知，看不出）保留时间主峰2.5min，后有二个较大杂质（3.9，4.3分钟）。
  色谱条件，C18柱，250mm长，波长275nm，流速1.5ml/min，流动相甲醇：水=90：10，样品用乙酸乙酯：甲醇=1:1溶解，进样量10ul。
  客户方声称，我们以前做样品都没问题，不可能是我们做错，样品肯定不纯，不要。

B 厂家自找检测方：
  Agilent 1100 ，面积归一化含量99.8%，主峰保留时间6.6min，样品很干净，分析时间20分钟。
色谱条件：C18柱，规格不知，波长275nm，流速1.0分钟，流动相甲醇：水=90：10，样品用甲醇（乙醇）溶解，后也按A方溶解，结果一样，进样5ul。

C 厂家合成人员：
认为，合成的含量不会这么低，熔点合格，核磁分析纯度高（是以前不同批号），虽然颜色较深，含量不可能相差这么大，我敢打赌样品很纯。

厂方其它人员，无计可使，只好再找一家检测。

  我拿到样品，仔细询问有关情况，准备星期一分析做出判断。我的问题是：

  究竟A和B二个检测，那个正确，什么原因，为什么会产生这种如此巨大的差别。明天在分析前，发上我的初步推理。

推理：

         公说公有理，婆说婆有理，但我们还是要从实际出发，分析出现偏差的原因，那天，我仔细询问了送样人，尤其几个具体的细节，并根据我的经验做出如下判断。

   其问题的关键是，杂质峰为什么有的有，有的没有。从HPLC的分析规律，在C18上分析非极性的化合物，不同厂家色谱柱之间的差异是很小的，除了保留时间的整体偏移外，因此在A柱上出现的杂质峰，必然在B柱上出现，根据保留时间估算在10分钟左右出现，而B做到了20分钟，并判断不止进样一次，不存在漏峰的问题。因此同一样品，如果稳定的话，既然在B柱上不出现，那么在A柱上出现的杂质峰应该是假的，否则无法解释。
   那么这杂质峰哪里来的，在上面的色谱条件中已经提到，A用乙酸乙酯和甲醇1:1溶解，而B用乙醇溶解，根据我的经验，做HPLC的一般都是用HPLC的试剂，在275nm是不可能存在杂质的，而乙醇即使不是HPLC级，就是分析纯在275nm也没有紫外吸收。唯一的来源是乙酸乙酯，一般实验室不会有HPLC级的乙酸乙酯，而且乙酸乙酯有一定的紫外吸收，不用于反相色谱。极可能是用了普通的乙酸乙酯，也许是化学纯，我想大家可能明白了。
   一线的合成人员是大概知道产品的质量的，1-2%的偏差是无法判断，10-20%的误差肯定会感觉到，而且他也会用其它方法来验证其合成的纯度，因此综合上面的分析，最大可能的原因是用了不纯的乙酸乙酯作为HPLC的样品溶解试剂。虽然，A的分析人员，操作熟练，但没有对溶解试剂进行空白分析，想当然了。
   下面我用自己的方法，重新分析样品，来验证我的判断。

分析：

      经过试验，样品能溶于100%甲醇，就不用其它试剂。
      称取约40mg的样品于50ml容量瓶中，用甲醇超声溶解，C18柱，150*4.6mm，流动相为甲醇：水=92：8，流速1.0ml/min, 波长275nm，220nm，230nm。
      发现虽然最大波长为275nm，但是响应较小，用吸收相对较高的230nm作为定量的波长。
      面积归一化法，样品和对照品的含量分别为97.4%，96.8%。外标法测定样品含量为标样的100.9%。
      样品的杂质峰在主峰的前面，主峰后无杂质峰。

结论：
      可以肯定A做的是错的，符合我先前的判断，应该是乙酸乙酯的问题，但A做的外标法含量这么低的原因无法理解，是不是还有其它的因素？