兽药残留检测有效净化技术—免疫亲和层析

　　是很普遍, 有的时候免疫亲和柱上的洗脱物的峰不是很尖, 因为解吸附作用比理论上要慢。为了解决峰平和基线不稳的问题,Moretti 等(1992) 将免疫亲和柱直接偶联到C18RP2HPLC 上测定牛奶和肉中氯霉素,IAC 柱上的洗脱液在HPLC 预柱上浓缩, 最后进入仪器的分离柱进行检测目标化合物色谱检测后没有杂质干扰, 而且3 个月内重复使用检测了150 个样本而柱容量没有降低。Farjam 等(1988) 成功的应用柱切换技术, 以IAC 作为预柱, 偶联液谱法检测牛尿中去甲睾酮, 检测限为0. 05 μg/k g。免疫亲和预柱可以使用6 个月, 净化100 多个样本而没有效率的降低。

　　Ben jam in 等(1997) 建立了以IAC 为基础的, 与LC/EM S 或LC/ETMS 联用的克仑特罗检测方法。

　　3. 3　多残留免疫亲和色谱(M IAC)

　　多残留免疫亲和色谱(M IAC) 更加集中了免疫亲和色谱的优势, 可在一个层析过程中提取多个样品。亲和柱上偶联一种抗体提纯几种结构相关的簇异性抗原, 或偶联多种抗体分别提纯多种交叉反应率低的分析物都是常用的方式。M IAC 对于离线和在线方式都可应用。V an 等(1989) 用此技术分析了肌肉中pg 量的去甲睾酮与甲基睾酮。琼脂糖凝胶用2, 2, 2-三氟乙烷磺酰氯活化, 结合的合成代谢类固醇用2 m l 50%乙醇淋洗,M IAC 柱依次用90% 甲醇、0. 1M 醋酸钠和磷酸缓冲液再生, 最后提取物用GC/M S 检测。回收率0. 5 μg/k g 时达80%。M IAC 净化柱可再利用25 次而没有容量损失, 检测最低水平为0. 5 μg/kg。V an 等(1992) 又建立了B-肾上腺素的多残留分析法, 以抗氮-叔丁基和氮-异丙基的2 种抗体为介导的免疫亲和层析为净化手段, 通过GC/M S 进行定性定量分析, 成功的测定了克仑特罗和塞曼特罗等一系列B2肾上腺素, 此类药物中基本具有2 个抗体结合位点中的一个。其对照试验使用的是同位素内标法, 回收率可达(101±5)%。

　　李俊锁(2000) 完成了磺胺类药物的免疫亲和色谱法的检测。利用抗磺胺类药物的簇特异性抗体制备免疫亲合柱, 能够同时提取复方磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶碱、磺胺嘧啶、磺胺喹恶啉等8 种磺胺类药物。

　　反相色谱紫外检测猪肉中添加10～ 100 μg/kg 时, 回收率为70. 8%～ 94. 1% , 检测限达到1～ 2 μg/kg。

　　3. 4　放射荧光检测法

　　放射荧光检测法也是一种很好的定量方法。Shelver 等(2002) 应用免疫亲和层析的样本净化技术检测B2肾上腺素兴奋剂莱克多巴胺及其代谢物。他们以单克隆抗体为配基, 并结合了放射性亲和层析作为检测方法。[ 14C ]莱克多巴胺和[ 14C ]

　　莱克多巴胺类似物添加入牛尿, 用RAC2IAC 方法净化检测, 其净化后所有样本包括肝、肾、肌肉, 都能继续做液相色谱分析和液体闪烁计数仪的检测。

　　3. 5　后柱免疫检测(postcolum nimm unodetection)

　　色谱免疫分析法也能检测其他色谱柱的洗脱液(Hage 等, 2001) , 主要是把固定抗体的后柱或固定有类似物的柱接于HPLC 的接口处, 然后进行直接检测或免疫测量分析。如将HPLC 柱流过液与含有标记抗体或Fab片断的溶液相混合, 然后将混合液通过固定有分析类似物的柱, 与抗体或Fab 片断结合的分析物会流过柱, 达到检测器。地高辛、生物素都用此法进行检测过。

　　3. 6　其他色谱免疫分析法

　　色谱免疫分析法包括竞争结合免疫分析、免疫测量分析、同质免疫分析及酶联免疫亲和色谱等很多种。但是这些方法主要的应用是在医学检测方面。随着农业现代化的推进, 兽药、添加剂残留检测也会逐步向这一方向发展, 提纯、检测一体化, 一直是我们的目标。

　　4　结语

　　以低分子量分析物为目标的免疫化学方法是现在兽药残留检测的发展趋势, 免疫亲和色谱作为理化测定技术的净化手段, 可使兽药残留分析将免疫技术的高选择性和理化技术的快速分离和灵敏性融为一体, 避免了IA 直接测定样品信息量太少、假阳性或理化分析技术选择性低等不足, 虽然其在残留分析中的研究与应用尚属于探索阶段, 但已展示了广阔的发展前景。尤其是色谱免疫分析法结合了色谱的高效性和免疫的特异性, 是残留分析的主要研究方面。而且一旦拥有了大量性质均一的纯抗体, 如单抗或工程抗体, 这项技术发展的潜力非常之大, 它的净化效率也是其它净化方法无法比拟的。