通过优化色谱柱规格实现曲安西龙快速高通量分析

引言

　　实验室需要通过加快高效液相色谱的分析时间来改进生产能力和不愿改变已被证实的耐用方法之间的矛盾，在您首次使用耐用的HPLC 的配件时，就能够被缓和或者被实际上消除。

　　例如，许多美国药典（USP）方法指定采用传统的4.6 × 250 mm，填充5 μm C18（L1）颗粒的色谱柱。使用这些色谱柱的分析时间一般长达30 分钟。然而随着更新技术的采用，在较短的色谱柱中填充较小的颗粒，可以在不损失色谱分离度的情况下显著地缩短分析时间。这一应用表明，通过缩短色谱柱的长度和降低粒径能够容易和可靠的改进USP 测定曲安西龙的方法。

　　曲安西龙是一种抗炎甾体类药物，根据其给药途径的不同可以被用来治疗许多种疾病。其口服该药可以产生免疫抑制的作用，有效治疗风湿性疾病、过敏性反应、狼疮和其它免疫系统疾病。通过吸入给药，可以用来治疗慢性哮喘。它也可以被局部外用治疗许多皮肤疾病，例如接触性皮炎、湿疹、牛皮癣甚至蚊虫叮咬。它还可以通过注射给药产生长期持续的肾上腺皮质激素作用。

　　USP测定曲安西龙的标准方法是采用3.9 mm × 30 cm的C18 色谱柱（L1），254 nm [1] 紫外检测波长。流动相采用水和甲醇（40:60 V/V），流速为1.5 mL/min。在这个方法中，首先被洗脱的是曲安西龙，随后为内标氢化可的松。

色谱柱长度和粒径的可扩展性

　　可扩展性是指通过改变一个HPLC 方法的色谱柱直径和/或长度和粒径，其仍然保持最初的HPLC 方法分离特性的能力。为了测试三个不同的ZORBAX StableBond  C18 色谱柱长度和粒径的可扩展性，图1为USP测定曲安西龙的三个叠加色谱图。

　　图1 中上图是用原来的方法得到的，采用内径4.6 mm，长度250 mm 的标准色谱柱尺寸，中间的色谱图为较短的色谱柱和填充较小粒度的填料。较短色谱柱的优势在提高分析速度和灵敏度的同时保证足够的分离度。USP 规定曲安西龙和内标氢化可的松之间的分离度应不少于3.0。ZORBAX StableBond (SB)-C18 色谱柱可以提供大于该方法所要求的三至四倍的分离度。更重要的是，使用最短的色谱柱（50 mm）和较小粒径的颗粒（1.8 μm）可以将分析时间缩短五倍，同时灵敏度增加二倍。所有的这些改进都可以通过简单的更换色谱柱获得。

粒径对选择性的影响

　　由于球形硅胶颗粒和自身键合相的重现性，通过改变色谱柱尺寸和粒径可以使生产效率得到提高。高度规范化的ZORBAX 硅胶制造过程、有机硅烷的键合过程和色谱柱的标准化测试等可以确保使用者自由的更换色谱柱而不会改变选择性及最终影响分离度。测定这个规范度的方法是在不同粒径之间比较选择性因子。选择性是保留因子之比。图2 为采用4.6 × 50 cm的色谱柱分别填充5、3.5 和1.8 μm 的SB-C18 颗粒，用1.5 分钟的时间分析曲安西龙的叠加图谱。对于这三个色谱柱而言，容量因子（k）重现性在1.5%之内，相应的选择性因子（α）表明不同大小键合相的颗粒在化学性质方面是非常相似的。

色谱柱内径的可扩展性

　　从图1 和2 可知，分离的可扩展性与色谱柱的长度和粒径无关。我们也将可扩展性作为色谱柱内径的一个函数进行了测试。图3 为USP 方法使用长度相同但内径不同的色谱柱分离曲安西龙的三个叠加色谱图。

　　流速被调整到通过公式1 可以得到的相等线性速度：
　　F₂ = F₁ (id₂/id₁)² (1)
　　此处F₂ 和F₁ 分别为新的和原来的流速，id₂ 和id₁ 分别是新的和原来的色谱柱内径。颗粒完全相同的选择性允许进行直接的方法转换。分离度可以被保持，灵敏度随着内径的降低而增加。后者的特征在一个样品质量有限且需要用极小量的样品获取最高灵敏度的情况下显得尤为重要。请注意色谱峰高度的增加与色谱柱内径平方的倒数成比例。更多的优点是，溶剂的消耗可以按照相同的比例减少而不会损失分离度和速度。

结论

　　新的HPLC 色谱柱技术的发展可以提高实验室的生产效率，容易用于已被证明的可靠的分析方法。使用高度规范化制造的ZORBAX StableBond C18 快速高通量色谱柱可以得到选择性相同的分离，而与色谱柱尺寸或粒径无关。改进了USP 测定曲安西龙的方法。通过简单地更换色谱柱可以在保有原来分离度的基础上，使分析时间缩短五倍，灵敏度增加两倍。