不加三乙胺进行含氮化合物的色谱分离

引言

　　用反相HPLC 分离碱性化合物时，色谱峰的拖尾问题是大多数色谱工作者非常关注的问题。碱性和含氮化合物能形成能满足分离和定量要求的对称峰。由于许多生物活性化合物都含氮，因此给这些药物和植化成份的HPLC分析带来了困扰。

　　用反相HPLC分离碱性化合物时，色谱峰的拖尾问题是大多数色谱工作者非常关注的问题。碱性和含氮化合物能形成能满足分离和定量要求的对称峰。由于许多生物活性化合物都含氮，因此给这些药物和植化成份的HPLC分析带来了困扰。

　　有几种克服硅醇基相互作用所致峰拖尾的办法。常用的措施是降低流动相的pH值，一般pH值小于3 时硅醇基将不再引起峰拖尾。在pH 值小于3 时，硅胶基质上的硅醇基被质子化（硅醇基的pKa 约为3.5），从而使硅醇基与溶质的相互作用减少。但是，这样也可能改变了分离的选择性和分离度，因此也不一定是好的选择。

　　第二个措施是提高流动相的离子强度。通过增加流动相的缓冲容量，抑制碱性化合物与硅胶之间的相互作用。但是，当增加的缓冲液在仪器内外/在进行色谱分析时发生沉淀，特别是在泵密封垫上发生沉淀时，可能会带来其它问题。应注意根据缓冲范围使用适当的缓冲液。表1 列出了几种最常用的缓冲液。

　　另一个可能的解决办法是在流动相中添加三乙胺(TEA)。TEA作为一种竞争碱，减少了固定相硅醇基的可用性，也减少了分析物与硅醇基之间的相互作用。

　一些色谱工作者不赞成在流动相中加入竞争性胺，因为这使流动相添加了额外成分，将给色谱柱造成不可恢复的改变。要从色谱柱上洗掉较强的胺，如TEA，非常困难。这一现象的一个例子就是，系统中使用TEA后，正离子模式电喷雾LC/MS一直有m/z 为102的离子，说明污染的不只是柱子，还有管路[1]。要除去TEA，需要用5% 到10% 的醋酸清洗系统。也就是说，被TEA修饰过的柱子不再适用于那些流动相中不含TEA 的应用。TEA 的作用是竞争性碱，让可能反应的硅醇基饱和，从而减少峰拖尾的可能性。对大多数分析来说，10 mM的TEA已经足够，但许多情况下可能使用得更多。而且，TEA的碱性很强，如果添加到没有缓冲或弱缓冲能力的流动相中，可能导致溶剂pH值急剧升高，可能会损坏色谱柱，进而影响分离，最终缩短柱寿命。最好的解决办法是使用对TEA需求最少的色谱柱。

　　Eclipse Plus 采用了专利的硅胶处理技术，改进了键合和封端工艺，不用添加TEA，靠色谱柱本身就能降低峰拖尾。

实验部分

　　所有分析都在Agilent 1200 上进行，系统包括一个自动进样器、二极管阵列检测器、二元泵、脱气机、柱温箱。法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平样品购自Sigma Aldrich（St. Louis，MO，美国）。将这些样品溶解在50/50 MeCN 乙腈/水中。白毛茛样品在当地购买，按照参考文献2 中的步骤，用70/30/0.1% v/v/v 水/乙腈/磷酸提取，超声、离心，用提取溶剂稀释。黄藤素、黄连素和白毛莨碱标准购自Sigma Aldrich，用流动相配制。用这些标准品鉴定白毛茛提取物。

结果与讨论

　　图1 是Eclipse Plus C18 柱和另一种C18 柱上分离三种治溃疡药物：法莫替丁、甲氰脒胍和哌仑西平（添加TEA和不加TEA）的色谱图。这三种含氨基药物的结构见图2。甲氰脒胍和法莫替丁是组胺H2-受体拮抗剂，通过关闭产生胃肠液的通路治疗治溃疡。哌仑西平是一种M1-竞争性毒蕈碱受体拮抗剂，能抑制胃酸的产生。治溃疡药是最常用的药物。从图1 中可以看出，加入10 mM 的TEA后，三种分析物在C18 柱上的峰形得到了改善。加入TEA后哌仑西平峰的拖尾因子从没加TEA的1.74 变为1.02。但我们注意到，只要换成Eclipse Plus C18 柱，甲氰脒胍和哌仑西平的峰形和柱效都有了改善。实际上，这些峰的拖尾因子与使用了TEA的C18 非常接近，柱效更高。用Eclipse Plus C18 分析时，不需要任何流动相改性剂就能得到很好的峰形和柱效。

　图3 显示了Eclipse Plus C18 柱在分析功能食品白毛茛中的应用。白毛茛一直用做抗菌、抗炎、减充血剂，用于治疗各种肠道紊乱，是使用最广泛的功能食品原料之一。采用一种通用的方法[2]，评价Eclipse Plus C18和另一种C18柱，加TEA和不加TEA的分离效果。

　　在这个例子中，我们测定了500-mg 市售白毛茛根的提取物。白毛茛的两个主要成分是黄连素和白毛茛碱。方法中提到了黄藤素，但是在测定的植物Hydrastis Canadensis L（北美黄连）中没有检测到。这些氨基化合物的结构见图4。

从色谱图中可以看出两点。第一，与另一个C18 柱相比，黄连素在Eclipse Plus C18 上的峰形有所改进。第二，随着TEA的添加，C18 柱的选择性有了明显改善。最后要注意的一点是，在含TEA的色谱图开始处有许多鬼峰或负峰。因为添加组分(14 mM TEA)加入到流动相中后，又加酸重新调节pH，简单的流动相变复杂了，甚至变脏了。包括高质量的新鲜试剂的最好的实验室操作，可以避免这一问题，但流动相污染的可能性仍然存在。更好的选择是不加TEA。

结论

　　由氨基和硅醇基离子化产生的峰拖尾现象，通常可以通过降低流动相pH、增加缓冲液离子强度，或添加竞争碱，如TEA，得到缓解。这些措施虽然减少了峰拖尾，但也可能给方法开发带来挑战，如选择性或分离度变差，降低柱寿命等。新的解决方案是用Eclipse Plus C18 固定相。它的硅醇基活性低，能为碱性化合物提供卓越峰形和柱效。