悬滴中的生物分析化学

声学悬浮仪能简化单个颗粒或单个液滴的各种测量。把液滴或颗粒悬浮在固定超声波的节点上。避免了分析样品时由于手触及容器壁可能引起的任何干扰。在脂肪化合物的研究过程中说明了悬浮液的使用。研究脂类分解的启始和终止时间时，实验很迅速(通常60?120s)。该技术特别适合以单细胞水平研究自然环境中的动态过程。非扩散检测技术使用了结合有成像技术的荧光光谱。

The acoustic levitator facilitates a variety of measurements on single panicles or single drops of liquid. The drops or panicles are levitated at the nodal points of a standing ultrasonic wave, thus eliminating any interference that might arise from the walls of a container used to handle and analyze the sample. The use of the levitation instrument is illustrated in a study of adipocytes. Experiments are fast (usually 60-120 sec) during which time both the activation and inhibition of lipolysis are studied. The technique is particularly suited for the study of dynamic events in nanlral environments at the single cell level. Noninvasive detection techniques employ nuorescence spectroscopy combined with imaging.

        近年来，对于能够满足在细胞和亚细胞水平进行生物学研究的分析技术的需求日益增长^[1]。尽管目前人们已能够对单个的原子或分子进行计数，但处理单个细胞阶情况要复杂得多^[2]。由于复杂的混合组分同时存在，可能对目标测量结果产生干扰。分辨足够量的潜在干扰与分析物是关键所在。可用于解决这个问题的一种方案是在进行真正的分析测试(如：毛细管电泳，一种以适于生物和小量样品著称的技术)之前先进行化学分离^[3]。可是伴随着小型化的主要问题是，用于处理和分析样品装置的非特异性吸附，以及由周围器壁导致的光学干扰^[4]。因此未来这一领域对分析仪器开发的要求将围绕对器壁的改进问题。

　　作者为解决这一问题所作的研究是应用悬滴技术。声学悬滴仪很容易实现对单个颗粒或悬滴的各种研究，悬滴能够被悬浮于超声波的节点。这种方法可以将悬浮物体固定在一特定的位置，除了其周围的媒体(通常为空气)之外，这种研究不受任何接触表面的干扰^[4，5]。可以将活细胞置于这种悬浮液滴中，采用特殊设计的分散器引入不同的物质加以研究，细胞对这些物质的响应可以通过荧光成像技术监测^[6]。试验仪器装置如图1所示。

　　完成单细胞分析的能力是非常重要的。单细胞分析不仅能够用于研究细胞群中细胞的同质性和年龄，探讨细胞的物理特性与其化学组成之间的关系，也可以确定细胞群体相对于单个细胞的协作效应。

　　单细胞研究对于临床诊断和治疗具有重要意义，因为通过将细胞分开来检测，会使发现非正常细胞的机会增多。对于健康的细胞和生病的细胞，药物的摄取量可能差别很大，对于这种多变性的认识，可能对了解复杂细胞环境中的细胞功能和完善药物的设计及控制药物的副作用有利^[7]。

　　在人体中，细胞处于细胞外部分子的恒定影响下，所有细胞外部分子都会通过与细胞表面受体的作用而影响细胞的行为。这些分子包括配体、细胞内生的物质和细胞外基体蛋白质。配体导引细胞表面通过血流(如荷尔蒙、生因子、胞浆)，细胞内产生的物质对相邻细胞产生影响。在我们身体的细胞中包含内部通信网络，只有细胞之间的通信正常，身体的功能才能正常。一个细胞中的信号传输起始于信使分子(如荷尔蒙)。它与细胞表面的受体分子结合，细胞通过特殊的信号通道，将信使分子的命令传输到响应和完成任务的分子。例如，在机体需要能量的时候，脂肪细胞对β-肾上腺素响应后将游离脂肪酸和甘油释放到血液中(图2)^[8]。

1 实验

　　实验装置如图3所示。超声波发生器来自Dantec／invent Measurement Technology GmbH(Erlangen，Germany)。在超声波发生器产生的超声波场中，包含有活细胞的缓冲溶液液滴被悬浮起来。通过特殊设计的自制液滴分散器，将不同的物质加入到包含有细胞的悬浮液滴中，细胞通过荧光成像检测监控。β-肾上腺素的加入启动脂肪动员激素的脂解作用，导致质子的释放，使周围缓冲溶液的pH变化，而胰岛素对抗这种影响，也会导致pH的降低。去甲肾上腺素由Sigma公司提供，人胰岛素来自Novo Nordisk(Gentofte，Denmark)。小液滴的蒸发作用会对荧光强度产生影响。为了抵消这种作用，采用分配器连续加水，以保证小液滴体积不变。将HPTS用于pH监控，汞灯和光导纤维用于提供435：405nm比率的激发光，发射光在510nm处检测。带有1100 x 330像素的CCD相机用于收集小液滴的图像。小液滴的积分强度通过对图像中所有像素强度加和得到。本底校正程序采用Matlab编制(The MathWorks Inc.，Natick，MA)。

2 结果与讨论

　　通过对活细胞内部信息系统的开发，采用包含活细胞的悬浮液滴对脂肪细胞的反应加以研究已有报道^[6]。图4a给出了脂解期间单一脂肪细胞的荧光强度LC，及不包含脂肪细胞时的空白小悬浮液滴的对照结果。图4b给出了12个脂肪细胞脂解反应的启动和终止过程。可以通过任意数量的细胞完成分析。悬浮液滴方法的优点之一是实验耗材少，如只需极少量细胞、试剂等。另一方面，由于无接触表面，防止低浓度化合物在装置器壁上的吸附。实验速度很高，对于脂肪细胞的激活和抑制的研究可以在60到120s内完成，试验所需总时间主要取决于细胞的类型、候选药物的种类和所研究的反应类型。

　　因为我们要检测整个悬浮液滴免受不必要的干扰，所以采用远程监测的方案是非常重要的。将荧光光谱或成像技术相结合，是非介入检测的有力工具。这种方法特别适用于在单细胞水平研究自然细胞的环境和动力学活动，如对于新药的筛选、药物副作用的研究及对细胞之间反应的探讨。该系统也可以用于研究不同种类细胞如脂肪细胞和β-细胞之间的通讯^[9]。在活细胞体系中所研究的物质通常有β-肾上腺素、β-阻断剂、β_3-相互作用物及类胰岛素等药物。由于所需细胞量很少，用此种方法可以减少新药示踪过程所需的动物数量，也可以用于分析活体解剖或从骨髓中获取活细胞。例如，在癌症诊断中，用于分析单个活细胞并比较它们与那些受控细胞的反应。

　　悬滴技术可用于毛细管电泳分析前的样品富集，这在前文已得到证实^[5]。将悬浮小液滴进样到毛细管中，并进一步用于毛细管电泳分析也是可能的，它还可能用于分析在悬浮液滴中加入药物后的细胞组成。未来的研究将集中在将悬滴中的脂解反应控制在不同的活性阶段，然后将其注入到毛细管中以进行下一步毛细管电泳分析。这种方法可以测得由于某种刺激引起的细胞内的变化。

参考文献:

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2. Jaleway SC, de Mello AJ, Russell EL. Miniaturized total analysis systems for biological analysis. Fres J Anal Chem 2000;366:525-39.
   
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4. Welter E, Neidhart B. Acoustically levitated droplets-a new tool for micro and trace analysis. Fres J Anal Chem 1997;357:345-50.
   
5. Petersson M, Nilsson J, Wallman L, Laurell T, Johansson J, Nilsson S. Sample enrichment in a single levitated droplet for capillary electrophoresis. J Chromatogr B 1998;714:39-46
   
6. Santesson S, Andersson M, Degerman E, Johansson T, Nilsson J, Nilsson S. Airbome cell analysis. Anal Chem 2000;72:3412-8.
   
7. Yeung ES. Chemical analysis of single human erythrocytes. Acc Chem Res 1994;27:409-14.
   
8. Degerman E, Rahn Landstr6m T, Wijkander J, et al.Phosphorylation and activation of hormone-sensitive adipocyte phosphodiesterase type 3B. Methods: ACompanion to Meth in Enzymol 1998;14:43-53.
   
9. Eliasson L, Renstrom E, Ding WG, Proks P, RorsmanP. Rapid ATP-dependent prlming of secretory granulesprecedes Ca2+ -induced exocytosis in mouse pancreatic B-cells. J Physiol 1997;503(2):399-412.