离子阱质谱在蛋白组学中的应用

质谱(MS)是识别蛋白及其特性的重要手段。许多蛋白质研究人员，特别是具有生物学背景的人，对于基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术和二维凝胶(2-D gel)电泳联用是十分熟悉的。研究表明，HPLC与离子阱串联质谱(LC-MS-MS)联用能够高效的分离蛋白质与肽，该体系对于识别蛋白质及表征翻译后修饰十分有用。

Mass spectrometry (MS) plays a key role in protein identification and characterization. Many protein researchers,especially those with biology backgrounds, are more familiar with the use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) instruments in combination with 2-D gel electrophoresis. Research experience, however, indicates that HPLC coupled with tandem ion trap MS (LC-MS-MS) permits the highly efficient separation of proteins and peptides.moreover, this hyphenated system is particularly useful in protein identification and for characterizing posttranslational modification.

      现在人类基因组计划已经告一段落，研究人员开始将研究重点集中到蛋白组学上。蛋白组学是研究生物体中蛋白质的表达、相互作用以及修饰的科学。了解蛋白质的特征能够使得人们更加有效和系统地开发及确定新的药物靶标，并且能够加速新的诊断方法及治疗药物的发展。

　　质谱是识别蛋白及其特性的重要手段。基质辅助激光解吸离子化?飞行时间质谱(MALDI。TOF)技术和二维凝胶(2-D gel)电泳联用对许多研究蛋白的科学人员，特别是生物领域的研究者具有非常大的吸引力。研究结果表明，高效液相色谱与离子阱串联质谱(LC-MS-MS)联用能够高效地分析蛋白质和多肽，并且特别有利于蛋白质的识别及其翻译后修饰的表征。

　　离子阱质谱非常有利于蛋白组学的研究。它能够有效地收集离子和提供大量的碎片信息以及特别适合蛋白质阶快速测序。

　　蛋白质的快速识别和表征是非常重要的。蛋白组的研究比人类基因组的研究困难大得多，人类基因组有30000?40000个基因，而人体中所含有的蛋白质的数目约有300000种或者更多。这意味着研究者需要一种比gel／MALDI-TOF方法更加快速的技术来进行蛋白质的识别。

1 利用离子阱LC-MS-MS技术的两个实例

　　下面列出两例来说明离子阱LC-MS-MS技术的优点。第一例是，Thermo Finnigan公司(San Jose，CA)的研究人员最近利用LC Surveyor^TM HPLC、LCQ ^TM Deca离子阱质谱和TurboSEQUEST^®软件(均由Thermo Finnigan公司提供[如图1])测定了Hep-G2(human liver hepatoblastoma)细胞分泌的蛋白质。在5h内以较高的置信度识别了95种蛋白质。

　　为了进行比较，研究人员在网上www．expasy．ch／cgi-bin／map2／def?HEPG2SP HUMAN站点发现丁关于Hep-G2(human liver hepatoblastoma)细胞中蛋白质识别的研究报告。这篇报告是利用传统的二维凝胶电泳和许多分析技术联用。虽然总的实验时间没有列出，但熟悉二维凝胶电泳的人都知道，二维凝胶电泳分离这些蛋白质的时间总要超过5h。这篇研究报告显示仅有25种蛋白质被识别，而Thermo Finnigan研究人员的识别数目几乎是它的4倍。

　　第二例是最近完成的酵母蛋白组的大规模分析。Michael P．Washburn，Dirk Wolters和John R．Yates Ⅲ组织了这个研究。Washburn博士和Wolters博士工作于Syngenta公司的Torrey Mesa研究所(TMRI，San Diego， CA)。Yates博士工作于TMRI及Scripps研究所(La Jolla，CA)。

　　研究人员应用多维液相色谱、LCQ Deca串联质谱以及TurboSEQUEST库搜索软件进行啤酒酵母BJ5460株的蛋白组研究。这是迄今为止规模最大的酵母蛋白组研究。他们识别了1484种蛋白，图2列出本研究识别的蛋白类型。

　　以上两个例子说明不用二维凝胶电泳也可以进行蛋白质的识别。Thermo Finnigan公司的研究是采用一维色谱，而酵母蛋白组的研究则是利用二维色谱技术。他们各自都比以前二维凝胶电泳研究得到的信息多。根据TMRI的研究，二维凝胶电泳消耗时间长，而且在分离低丰度蛋白质、膜蛋白以及分子质量或等电点极端的蛋白质时，效率没有色谱高。

2 二维凝胶电泳／离子阱质谱联用的优点

　　与MALDI-TOF质谱相Lh，离子阱质谱用于蛋白质的研究能为二维凝胶电泳的研究提供更加有价值的结果。两种方法都是从凝胶上切割感兴趣的点，然后将蛋白质酶解成多狄。离子阶质谱在分析前，利用HPLC将多肽进行分离，这样可以大大降低混合物的复杂性。

　　二维凝胶电泳／MALDI-TOF质谱技术能提供有用的肽质谱图且能进行蛋白质的识别。但与LC／MS／MS相比，MALDI-TOF的识别结果不可靠，特别是当一个点中含有多个蛋白时。对于一个点的水解蛋白液来说，其中含有大量的多肽，并且经常含有修饰基团。一般来说，一个蛋白能水解出20～50种肽。用MALDI-TOF质谱测量多肽混合物时，待测组分不能完全离子化，对于一个蛋白得不到足够的肽信息，无法搜索肽数据库进行蛋白的识别。而LC-MS-MS联用能够检测到相当高的肽段数量和氨基酸序列，这样进行蛋白质识别就有了较高的可信度。

　　MALDI-TOF也不能进行翻译后修饰蛋白质的分析。具有离子阱的LC-MS-MS技术能够通过解析修饰导致的肽谱质量漂移提供修饰信息，并且能够提供修饰类型和修饰位点的结构信息。

3 蛋白组的鸟枪法测序

　　以前，许多研究人员就在讨论将蛋白质的鸟枪法测序技术(Shotgun sequuencing of protems)，作为快速识别与表征人体中蛋白质的技术。他们从人类基因组计划(Human Genome Project)中借用了这个词，人类基因组计划利用鸟枪法测定了人体基因序列。

　　鸟枪法测序也适合于蛋白组研究，但是要确定它在基因组中和在蛋白组中定义的不同是非常重要的。鸟枪法测序在蛋白组研究中切实可行，但远比在基因组中的应用复杂。

　　鸟枪技术对于人类基因的应用，包括利用聚合酶链反应(PCR，Hoffman-La Roche，Nutley，NJ)技术进行DNA克隆。研究人员将完整的基因在化学上碎裂成含有2000一10000个碱基的碎片。DNA的4种碱基中的每一个??腺嘌吟、胸腺嘧啶、胞嘧啶及鸟嘌吟都能在化学上修饰而发出它们独特颜色的荧光。用凝胶分离这些碎片，扫描后，用激光按颜色识别碱基序列。将这些序列信息输入计算机，该计算机能够记住这些碎片来源于何处且把来自扫描的信息放到原来的位置。用这个方法能够最终得到整个基因序列。

　　这是一种值得注意的技术，但它不同于蛋白质的鸟枪法测序技术。例如，通过PCR得到的DNA样品是比较简单的，基因是比较稳定的，它们的一般结构是可预测的，这些都使得基因的测序简单化。

　　蛋白质不只是由4种碱基组成，而且在另一方面蛋白质还是由20种氨基酸组成，因此比基因复杂得多。它们不能被克隆，样品的获得和处理变得更加困难。并且蛋白质分子非常大，结构不像基因那样可以预测。因此鸟枪法测序过程是很不相同的。为了测定蛋白组中这样的序列，首先将蛋白质酶解成多肽，然后将这些肽进行分离、离子化、分析并用MS检测。利用得到的肽质谱信息，搜索已有的蛋白质库，或者通过从头测序的方法，对数据库不存在的新蛋白质进行全序列测定。

　　蛋白质与基因不同，它非常不稳定，丰度和含量差别很大，细胞的代谢途径受蛋白质与蛋白质之间的相互作用的影响。综合这些因素，我们可以公正地说，在生物系统环境下基因测序就像进行一次快照，而对于蛋白来说就像进行一部电影的拍摄。

　　对于蛋白组的鸟枪法测序任务，离子阱能非常好地提供碎片信息??MS能进行n级扫描，这是非常有价值的。由于可以进行n级质谱碎片扫描，因此可通过对肽片进行多次裂解而得到特异性的识别与鉴定。

　　Thermo Finnigan 提供了Dynamic Exclusion ^TM这一部件，它增加了许多功能进行蛋白分析。Dynamic Exclusion首先进行全扫描来测量多肽峰和相对丰度。然后依次调节吸收强度、数据处理系统使离子阱分离并记录选定的离子的裂解质谱图。最高强度的离子被分隔并成碎片，然后是次高强度的离子成碎片，再后是第三个，甚至丰度很低的肽段离子也可以用这种全自动的模式得到检测。这就使高通量、自动化的蛋白质分析和翻译后修饰的全范围检测得以实现。

4 结论

　　蛋白组领域需要快速的分析工具来识别和鉴定蛋白质。LC-MS-MS离子阱质谱提供了高的速度和高的灵敏度，非常适合于蛋白组领域的研究。离子阱质谱作为一个广泛采用的技术，能为蛋白组的研究提供大量可靠的信息。