霉菌特异性定量聚合酶链反应（PCR）：霉菌分析中的新标准

摘要：霉菌在地球生物进程中是一个必需成分，无处不在。它们不仅能危害健康，例如导致感染和过敏，还能毁坏农作物、污染食品和医药品。因此，及时地发现并消灭多数有问题的霉菌是相当重要的。通过霉菌特异性定量聚合酶链反应技术的最新发展及应用，现在可以准确地识别室内的霉菌，并且利用其较高的定量精度，可以建立用于确定不正常霉菌环境的预测模型。

Abstract：Molds are an integral part of the earth’s biological processes, and as such are ubiquitous. But they can cause health problems, such as infections and allergies; they can destroy crops, and contaminate food and pharmaceuticals. Accordingly, it is important that the molds that are most problematic be identified and eliminated in a timely manner. Through the recent development and application of the technique of mold-specific quantitative polymerase chain reaction, indoor molds can now be identified accurately and with such quantitative precision that predictive models are emerging that can help define abnormal mold conditions.

    霉菌不仅能导致包括感染和过敏的健康问题，还能毁坏农作物，污染食品和医药品。它们是不可避免的。霉菌在地球生物进程中扮演着最基本的角色。多数有问题的霉菌能被发现，并且可以进行定量分析，以便及时地消除。通过霉菌特异性定量聚合酶链反应（MSQPCR）技术的最新发展及应用，现在可以准确地识别室内的霉菌。并且利用其较高的定量精度，可以建立用于确定不正常霉菌环境的预测模型。

1 MSQPCR是如何提高霉菌检测和定量的

　　MSQPCR是一种用于检测霉菌的高度精确和高灵敏度的分子技术。以前识别环境中霉菌的方法是在特定的培养基中培养霉菌，但实际上样品中的霉菌只有少数能够接受培养基，并在实验室生长。长期以来用于定量霉菌的方法是用肉眼计数霉菌孢子。这是一个非常缓慢、费力并且常常带有主观因素的过程，只有具有很高技能的人才能进行。

　　MSQPCR可以避免几个世纪以来一直沿用的用于识别和定量霉菌的方法的局限性。因为它是一种基于DNA序列的检测系统，所以具有客观性和特异性。

2 样品制备

　　为了评估室内环境中的霉菌，通常需要收集空气或者灰尘。第一步通过珠粒搅拌方法提取样品中的DNA（图1），这要花费1min的时间。对于大多数空气样品，简单地离心以后得到的悬浮物可以用于进行分析。对于灰尘样品，离心后得到的悬浮物需要进一步纯化。

　　与最初的PCR过程不同，定量PCR（QPCR，于1997年由应用生物系统公司（FosterCity），CA发展的）向初始的正向和反向引物中加入了一种双重荧光标记DNA探针（图2）。引物与探针和适量的酶及其他试剂混合从而完成反应。由于引物和探针是QPCR反应过程中关键的成分，所以它们一定要被设计成具有种属特异性。

　　如图3所示，将少量的样品DNA 抽提物（悬浮物）加入到含有用于特异霉菌的引物和探针的MSQPCR反应混合物中（步骤1）。对于每个待分析的目标霉菌样品需要重复此步骤。在序列检测热循环器中加热DNA（步骤2），这会导致双螺旋离解成单链。霉菌特异性引物和探针将与样品DNA发生相互作用。

　　现在有许多序列检测器的厂商；最近有综述介绍这些仪器^[1］。序列检测器可以进行MSQPCR中PCR反应的加热和冷却，也可以检测制备的DNA探针发射的荧光。这些仪器价钱从30到8万美金不等。这取决于可同时进行反应的数量（1到384）。

4 MSQPCR在家庭环境研究中的应用

　　人们通常都很重视家庭建筑中因过多霉菌生长所带来的危险。因此， 作者十分关注MSQPCR用于研究室内霉菌种群及其在一个家庭的居住环境中发生的变化。在一个家庭的居住环境中，当环境的湿度变得不正常时，某些种类的霉菌就会大量繁殖，而某些就会减少，还有一些会维持原状，甚至会出现新的霉菌（图5）。也就是说，室内空间的生态系统，包括霉菌种群，发生了变化。但是，由于室内环境之间也存在着极大的差异，人们不能期望所有的含有水分的房子或建筑都具有相同的霉菌生长机会。

　　美国环保署（辛辛那提，俄亥俄州）联合住房和城市发展部（HUD,华盛顿D.C.）正在进行一个跨越全美的全国性室内霉菌研究工作。MSQPCR技术正被用于这项研究。这项研究的目的是要获得发霉屋子和“正常”屋子中作为指标霉菌的GM值比较。研究者将利用这些大量的数据来更彻底地验证并确认GM比率值方法的可预测性。

5 MSQPCR在医院环境、食物和制药工厂中的应用

　　MSQPCR还有许多其他方面的应用。在医疗保健环境中，医院的真菌感染有着很高的致死率。因此控制感染的医师需要经常监测某些种类的霉菌，尤其是曲霉菌。MSQPCR的灵敏度在这些环境的监测中相当有用。医院在进行建设和翻新工程时，监督可能存在的致病性真菌是非常关键的。建筑工作能够激起各种类型的霉菌，包括那些最容易引起感染的霉菌。现在， MSQPCR提供的实时监控数据可以帮助医院的感染控制人员监控病人环境中潜在的致病性霉菌的出现^[4,5］。尽管霉菌是可以控制的，但前提条件中是我们必须及时地发现并快速地消除它们。

　　在农业生产方面，霉菌是污染人和动物食品的毒枝菌素的来源。霉菌也会威胁和毁坏庄稼。MSQPCR能够用于监测植物病原体以及田地和饲料储存仓中的致毒真菌^[6］。

6 MSQPCR用于环境霉菌分析的其他益处

　　MSQPCR除了具有高度的特异性和可以进行定量分析的特点以外，一个很重要的优点就是它的检测速度非常快。大约3h或者更少的时间就能得到结果。和需要数周之久的、低特异性的、非常古老的“标准”霉菌培养技术相比，这些优点说明MSQPCR是一项非常有用的技术。由于MSQPCR给霉菌分析领域带来了新的动力，我们处于一个了解和控制破坏性霉菌的新阶段。

　　目前100多种常见的有问题的霉菌已有了相应的DNA探针和引物。美国环保署促进了MSQPCR的使用，使得人们可以通过美国和欧洲一些已授权的公司获得该技术。

参考文献:

1. Pray LA. Consider the cycler. Scientist， 2004;18:34-37.
   
2. Vesper SJ, Varma M, Wymer LJ, Dearborn DG,Sobolewski J, Haugland RA. Quantitative PCR analysis of fungi in dust from homes of infants who developed idiopathic pulmonary hemorrhaging. J Occup Environ Med，2004; 46:596-601.
   
3. Meklin T, Haugland RA, Reponen T, et al.Quantitative PCR analysis of house dust can reveal abnormal mold conditions. J Environ Mon 2004; 6:615-20.
   
4. Morrison J, Yang C, Lin K-T, Haugland RA,Neely AN, Vesper SJ. Monitoring Aspergillus species by quantitative PCR during construction of a multi-story hospital building. J Hosp Infec 2004; 57:85-7.
   
5. Neely AN, Gallardo V, Barth E, Haugland RA, Warden G, Vesper SJ. Rapid monitoring by QPCR for pathogenic Aspergillus during carpet removal from a hospital. Infec Con Hosp Epi 2004; 25:350-52.
   
6. Vesper S, Haugland RA. 21st century mold analysis in the food industry. Food Qual 2003;Nov/Dec:39-40.