温度梯度和程序升温：溶剂梯度和传统HPLC 技术的有效可靠的替代方法
摘要：迄今为止，程序升温液相色谱（TPLC）在色谱学工作者中并没有得到充分的应用。它能够分离各种样品（有机和无机）并提供极好的结果。在更高的温度下，由于背压的降低我们可以使用更小粒径的固定相填料来达到更高的柱效。同时，由于高温下流动相粘度的降低，我们还可以在更高的流速和更短的分析时间下进行分离。
Thermal Gradients and Temperature Programming:
Efficient and Reliable Alternatives to Solvent Gradients and
Traditional HPLC Techniques
Jody Clark
Abstract: Temperature-programmed liquid chromatography (TPLC), hitherto an underutilized technique a mo ng chr om a to - graphers, offers excellent results for the separation of all kinds of samples, both organic and inorganic. Athigher temperatures, improved efficiencies can be achieved since backpressure is reduced, permitting the use of stationary phases with smaller particle sizes. Also, as a result of the reduced viscosity at higher temperatures, the separation
can be operated at higher flow rates resulting in much shorter analysis times.
在现代实验室中, 程序升温液相色谱法(TPLC)对于分离科学家而言只是一种为获得最佳分离而提供额外价值的技术,而没有完全把它当作一种通用的和具有极高效率的方法使用。在进行色谱分离实验时,仪器和色谱柱的种种限制已经制约了温度成为一个具有重要意义的参数。我们争论的焦点主要集中在硅胶柱对温度的稳定性差以及缺少足够的色谱柱加热设备。此外, 温度大于200℃的操作还需要设计一种能够消除温度不匹配效应的流动相预加热器。我们这里讨论的需要使用高温进行分离实验的仪器可能对于更常规的应用是无价的。程序升温给分析带来的直接好处是分离性能和结果的改善。
在较高的温度下,由于背压的降低,可以使用更小粒径的固定相填料来达到更高的柱效。同时这也允许我们使用更高的流速。由于温度逐渐增加的流动相以及在固定相中扩散速率的增加,Van Deemter 曲线将会趋于水平,因此可以多次在最佳流速下进行样品分析而获得在环境温度下达不到的分离效果。
1 用温度梯度替代溶剂梯度
图1 是利用等度流动相和温度梯度方法分离的镇静剂混合物。结果表明温度梯度方法可以替代许多溶剂梯度方法，从而使许多需要通过复杂梯度才能分离的样品只需通过等度模式就可以达到目的。我们是在一根H ypercarb 柱(Thermo Electron, Bellefonte,PA)上通过一个PolarathermTM 柱温箱(Selerity Technologies Inc.,Salt Lake City,UT)使用50℃到150℃的温度梯度进行分离的。其他需要用到的仪器还包括CM4000 泵(Milton Roy, Ivyland, PA)、真空脱气机(Alltech, Deerfield, IL)、UV200 可变波长检测器(Thermo Separations,Waltham, MA),和自动进样器(Alcott, Norcross, GA)。流动相是由50:50 的乙腈和pH 9.0 的
醋酸铵缓冲盐组成。5μ L 的样品在1.0mL/min的流速下注入。开始时，温度在50℃下保持2min,然后以30℃为间隔逐渐上升到150℃并保持10 min。
我们在相同的仪器上使用PRP - 3 柱（Hamilton, Reno, NV）进一步分离了标准蛋白质。同时，也采用了等度流动相和温度梯度。流动相是25 : 75 的乙腈和含有0.1% 三氟乙酸（TFA）的水组成。5μ L 的样品在1.0 mL/min的流速下注入。温度以30℃的间隔从40℃逐渐上升到150℃ 并保持5 min。5 种标准品在大约6 min 内获得基线分离，如图2 所示的色谱图。流动相粘度的降低就意味着流动相的流速对一根长为2.1 mm 并装有3 mm 粒径填料的色谱注的影响是重大的。
2 技术
尽管对色谱柱的选择是有限的，但我们已经可以成功地在带有不锈钢外套和不锈钢端部接头的聚合物、碳、氧化锆色谱柱上进行高温分析，标准的内径为4.6 mm 的色谱柱不能有效重现地将热量转移到流动相和色谱柱内部。只有当流动相被预先加热后，峰展宽才能被避免，这是因为低温的流动相进入到加热的色谱柱内时，沿着色谱柱管壁的流动相温度通常比柱中心的温度上升得更快。这种“温度不匹配”的现象通常在低于80℃会发生。
随着温度的逐渐升高， 水中的氢键效应也会降低， 从而在分离过程中水表现得更像一个中等强度的有机溶剂如甲醇。因此需要二元溶剂梯度的分离可以使用热梯度来处理。通过采用这种技术，使用者可以改变分离的保留值和选择性。为了成功地进行这类分析，TPL C 的柱温箱需要配备一个重量轻、体积小的预加热器接在色谱柱的入口管上，要求它在流动相进入柱子之前能快响应地将热量转移给流动相。这样流动相的加热就可以完全与鼓风干燥箱无关。为了做出精确的热分布图还需要对烘箱温度进行校正。
3 预加热器
我们要求预加热器能满足有效的流动相预加热。因此设计一个外表面包裹了一层镍镉绝缘线的1/16 英寸外径的不锈钢管（图3）。加热区是隔热的，在离这个加热区5 mm 处，一个小热电偶直接与之固定并用一个绝缘的电路连接起来。设计绝缘的热电偶是为了避免它受周围环境的干扰，从而能够对加热输入源提供必要的信息，以获得快速的响应。这就保证了探针能够读出管壁的温度。而这个温度就是钢管中心流体的温度。我们将整个装置装在一个不锈钢套中，重量不到2g，整个加热器的体积也不到1 μL 。
通过温度传感器，加热器可以以不同的流速在一个宽的范围热容量内自动地对流体的加热要求进行补偿。因此重量轻的预加热器可以很快地对程序升温进行响应。同时，还可以通过在跨过和流动相进口相连的预加热器的烘箱洞口处鼓入空气，使得在分析结束时装置能快速冷却，从而在运行结束后可以快速进行再平衡。
4 色谱柱
更快的扩散速率可以获得更高的柱效，从而可以改善分辨率和选择性。传统上，HPLC 使用的硅胶柱在反相条件下高于60℃时是不稳定的。填料一旦接触水，硅胶色谱柱就有可能发生降解。因此我们采用多齿状的聚合物保护硅胶表面，BlazeTM 系列的色谱柱（Selerity Technologies）就可以保护硅胶颗粒免受水解的破坏，它是一种在100℃时仍然稳定有效的色谱柱。Blaze 的多齿固定相可以保护硅羟基免受干扰。这是因为聚合物可以和硅胶上不同的位点结合，在不稳定的硅氧基上形成了一个保护帽（图4）。这种多齿硅胶固定相是专门为TPLC 配置的，从而弥补以前的缺陷和减少了柱降解的可能性。
我们对3 种色谱柱?? Blaze C8、PRP-1 和Hypercarb 在酸性、碱性、中性流动相条件下采用程序升温的方法进行了评价。它们分别是：水:乙腈、含有0.1%TFA(pH 2.0)的水:乙腈和乙腈：20mM 氨水（pH 10.0）。此外我们还在每根色谱柱上进行了空白温度梯度和溶剂梯度操作，从而使得我们在每根色谱柱上总共使用了8 次温度梯度和溶剂梯度。在35℃下采用二元溶剂梯度对7 种分析物（苯胺、苯乙酮、阿密曲替林、异丁苯丙酸、2- 苯基-2- 丙醇、水杨酸和苯代乙二醇）进行了分析。除了异丁苯丙酸质量浓度为1.30 mg/mL 外，其它每种样品的质量浓度均为2.50 ± 10% mg/mL。每种待测溶液都分别进样5 μ L，然后在流速为1.0 mL/min 条件下进行了分离。采用和每根色谱柱初始运行相同的条件，通过分析尿嘧啶和苯酚两组分的试验混合物，在每种流动相的色谱图对每根色谱柱进行检验。通过监测保留时间、柱效和峰形来检查色谱柱降解与否。
5 结果
对于每组条件，保留时间和柱效的偏差在大多数情况下为±10%。在极端pH 和高温条件下保留时间和柱效没有发生变化。在分析过程中，背压没有出现明显的变化，固定相也没有降解的迹象。此外，这次柱评价以后，我们在每根色谱柱上进行了几百次分析，没有看到固定相损坏的情况发生。因此，在100℃到200℃ 高温条件下可以采用这些色谱柱进行程序升温TPLC。在酸性和碱性条件下，色谱柱也没有出现毁坏。当我们采用温度梯度替代溶剂梯度进行分析时，可以得到几乎相似的色谱峰。
6 结论
实验表明，在仪器能同时满足TPLC 要求的条件下，温度是一个重要的参数，它可以用来调整分离度和缩短分析时间。同时色谱柱也必须得到优化，它需要能够承受温度的显著变化而避免降解以及再采用程序升温技术时能够进行常规分析。因此，可以看到TPLC 存在下列优势：缩短的分析时间、更高的柱效、通过温度调节选择性的能力、有机溶剂用量的减少以及在等度流动相下采用程序升温。
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