粘红酵母CIBAS A 1401苯丙氨酸解氨酶（PAL）的分离纯化与性质

　　1.PAL酶的分离纯化与性质

　　应用选出的高PAL活性的粘红酵母CIBAS A 1401-37号菌株，在Ⅱ级发酵至21h时，生物量达到最高，PAL酶活力最高，且能维持活力峰值期2～3h;在此时搜集菌体纯化该PAL酶最适宜。经试验发现，用直径0.5㎜的采用玻珠破壁5～6次时，有最佳效果;用硫酸铵分级沉淀时,选择40%～65%饱和度，沉淀效果最好。获得的粗酶液再经Sepharose4B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换，得到最终纯化倍数为139倍，收率为12.6 %的结果 。

　　经纯化得到的酶液，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析均得到单一蛋白带,证明该酶已经达到凝胶电泳纯，且其亚基大小相等。由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条带上，其PAL亚基的相对迁移率和由标准蛋白质迁移率所配的标准曲线，插值分析可得出该PAL的亚基分子量约为79.4kDa。

　　该PAL制剂在不同的金属离子氯化物体系中，除了Mg2+ 和Na+外，其它金属离子如Fe3+、Cu2+、Co2+、Hg2+等对其都有明显的抑制作用。

　　PAL的酶反应动力学参数：根据Lineweaver-Burk 作图法，在pH8.5，40℃条件下测得本粘红酵母CIBAS A1401 PAL L-Phe生成t-Ca的Km值为3.87×10-4mol/L。

　　在不同温度和不同pH值条件下测试发现：在pH8.5时，该酶的最适温度为40℃;在40℃，该酶的最适反应pH为8.5，在pH8.0～9.5 之间有较好的稳定性。在无防腐剂和保护剂的条件下，4℃和-20℃保存2周活力下降分别不到40%和20%。

　　该酶在50℃以下，尤其是在最适反应温度以及更低温度下，都有较高的稳定性，这就是为什么该菌株能用于工业生产L-Phe的优势所在。

　　本工作将粘红酵母CIBAS A1401 PAL的部分酶学性质与已经报道的高等植物PAL的性质作了比较研究，发现都不同程度地证实了酵母PAL与高等植物PAL有着相似的结构大小和生物学特性;但这并不说明它们就完全一样。据报道，酵母PAL的活性部位的结构与高等植物有着较大的差异，且PAL在植物和酵母体内所起的生理功能是有区别的。

　　2.PAL基础酶学问题辩析

　　据报道，PAL有酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia-lyase，TAL)活性，催化酪氨酸(Tyrosine，Tyr)解氨生成对一香豆酸(4-羟-肉桂酸);一般来说，TAL活性不总存在。有人认为该PAL存在两种酶形式，实验结果表明，其PAL和TAL最适PH不同，动力学参数(Km值，Kcat，Kcat/Km)不同，但都有类似的催化效率。

　　对于粘红酵母A 1401而言，在使用该菌种在发酵培养制作细胞作为PAL生物催化剂时，对其液体培养基中的两种芳族氨基酸(L-Phe，L-Tyr)作为PAL的诱导剂对其代谢利用过程的差异分析结果表明，该菌首先代谢利用L-Tyr，其次才是对L-Phe的代谢利用;由此可以推断本菌株经芳族氨基酸诱导生成的PAL酶系中也存在优势的TAL酶活性;这在本实验室的红酵母对三种底物，即间-羟-肉桂酸，邻-羟-肉桂酸和对-羟-肉桂酸生物转化制L-Phe结构类似物，即间-羟-L-Phe，邻-羟-L-Phe和对-羟-L-Phe(即L-Tyr)的筛选和制备合成试验中，实际上就是TAL(酪氨酸解氨酶)逆向生物催化合成天然(L-Tyr)和非天然L-Tyr的结构类似物，具有生物技术应用的重要性。

　　因此，从基础酶学角度分析，实际上该菌存在两种酶形式，即PAL和TAL;PAL/TAL的比率取决于菌种及其生理营养条件。不过通常认为两种酶活性均可对肉桂酸被直接立体氨化合成L-Phe起作用。表1给出了该菌株在生物催化剂制备阶段，优先代谢利用作为PAL诱导剂的Tyr，然后才是L-Phe的结果。由此表明该菌株存在两种酶的形式，且TAL可能较PAL占优势。