蛋白回收率能够达到95%以上?看看大咖们的超滤秘笈!

小师弟最近接了一个新项目,根据实验室师兄师姐的经验传授,选择了1/3截留分子量的超滤膜孔径截留新得到的重组抗体蛋白,但是却总感觉回收率不佳……

是不是这个批次的超滤管有问题?于是小师弟换了批次,结果仍然回收率不高。最后,小师弟求助了膜过滤和超滤的专家小赛。

根据经验,小赛建议他试用同样截留分子量的Hydrosart和RC膜材质的超滤管,结果,回收率果然就有了很大的提升!

由于超滤管使用不恰当或是超滤知识缺乏引起的问题,简直成了实验汪们蛋白实验不成功、效率低下的最常见原因之一。

上周的这些超滤离心管的使用问题你都遇到过吗?一经发出,好多小伙伴纷纷下载和申请试用。除此之外,还有哪些问题困扰着实验小白呢?

Q

有时候我用超滤离心管连水都离不下来,可能的原因是?

A

超过滤薄膜含有微量甘油。如果出现这种情况,先用0.1 N NaOH 清洗再离心。最后用缓冲液或去离子水水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用,如暂时不用,请保持润湿状态,避免重新干燥。另外, 有些水的水质本身杂质较多,或是不同水机对水的处理效果有差异,这个时候可以检查是否水机工作正常,然后用 0.2um 的针头滤器过滤水,然后再进行超滤,效果可能会好很多!

Q

在浓缩过程中如何减少蛋白质降解?

A

在浓缩过程中,不均衡的蛋白质、pH/样品缓冲液条件以及高剪切应力通常会导致降解产生。同样的,蛋白质的形状越呈线性,高离心力对结构的不利影响就越大。如果蛋白质呈线性、浓缩时间较慢,且离心力低于建议的最大值(约 50 % 较好),则影响会较小。对于更多的球状分子,建议使用最接近最小样品量的装置,这样可确保更大的表面积、减少堵塞概率并增加样品上的力。

尽管如此,您还应注意:如果您的蛋白质超滤膜材质选择不合适,或者您的蛋白质具有“粘性”,则表面积越大,非特异性结合的比率就会越高。诸如Vivaflow® 膜包等实验室用切向流膜包可为样品提供真正的平行流路,能够进一步确保最小的剪切应力。应注意的是,一般的搅拌细胞容器会施加相对较大的剪切应力。

对于pH/缓冲液条件,一旦选择了最优的缓冲液pH 条件,就应该在整个浓缩置换过程中维持这个条件。使用Vivaflow® 装置和离心式Vivaspin® 20 可以轻松进行缓冲液置换,即使浓度增加也可以保持正确的缓冲液平衡,您也可以在需要时添加新的缓冲液。

Q

可以用超滤管控制浓缩倍数吗?

A

首先,Vivaspin® 超滤管有最小回收体积,保证至少回收 30 μl的样本,并且不会让过长的离心时间导致样品干燥。另外,Vivaspin® Turbo 系列的尖角死体积回收器可以让小体积样品得到最大的回收。

另外,如果需要浓缩一定的倍数,使用超滤管也可以直接完成,不需要额外的步骤。首先,预先计算外管液体达到滤过孔的刻度线的位置需要的体积,然后减去样品要滤出的体积,就是需要预先加入外管的缓冲液的体积。先在外管中加入计算得到的缓冲液,待滤出液的体积流入外管缓冲液中,使液面达到滤出孔,则样品不再浓缩,浓缩倍数得到了固定,样品浓缩就是那么简单。

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