在本期的推送中，我们有幸和美国能源部联合生物能源研究所（The Joint BioEnergy Institute，JBEI）的 Dr. Yan Chen 合作总结，给大家带来安捷伦组学技术在合成生物学及生物燃料开发中的应用。
作者： Dr .Yan Chen, Joint BioEnergy Institute (JBEI)，USA；冉小蓉 博士（安捷伦科技）
分享来自美国能源部 Joint BioEnergy Institute 联合 Lawrence Berkeley National Laboratory，Technical University of Denmark，University of California, Berkeley 发表在 Biotechnology and Bioengineering 上题为 Production of jet fuel precursor monoterpenoids from engineered Escherichia coli 的文章。
文章链接：https://doi.org/10.1002/bit.26296
合成生物学意在以传统生物学知识为基础，结合系统生物学手段的测量和分析，设计新的生物系统或对原有生物系统进行深度改造，来高效率合成高价值目标产物，目前已经在代谢发酵、蛋白质工程、药物、医疗等领域彰显出巨大的应用潜力。在新能源的开发中，利用合成生物学技术对微生物和代谢通路进行改造来合成生物燃料及前体也已成为目前能源研究领域一个非常活跃的方向。
单萜类化合物作为高密度能量物质，在航空燃油的开发中前景十分广泛。然而天然的单萜类化合物源于植物，大量提取会造成对生态的严重破坏。随着合成生物学的快速发展，采用微生物的生物合成为单萜类化合物的生产提供了新的思路和途径。
本研究意在利用大肠杆菌（E. Coli）进行通路构建及菌株改造，结合组学技术的定量表征，异源高效生物合成单萜类化合物。
合成生物学技术改造甲羟戊酸途径
研究选用在 E. Coli 中异源表达甲羟戊酸途径（Mevalonate-dependent pathway , MVA）来合成单萜类化合物，选用了 1.8-桉叶醇、柠檬烯、蒎烯、芳樟醇为示范目标物。在 MVA 合成途径中，单萜类化合物以香叶基焦磷酸（GPP）为合成前体，同时 GPP 也是法尼基焦磷酸（FPP）合成的底物来源（图 1）。基于上述合成途径，本研究尝试通过在法尼基焦磷酸合成酶（IspA）引入定点突变，抑制 GPP 合成 FPP，从而来提高 GPP 转化为单萜类化合物的效率。
图 1. 异源表达甲羟戊酸途径合成单萜类化合物
多组学定量表征通路中的关键酶和代谢物
靶向蛋白组学：采用安捷伦 1290 UHPLC-6460 QQQ 标准流速定量蛋白质组分析策略，方法采用 0.4 mL/min 的常规流速，在 13 分钟内对 MVA 通路上所有的关键蛋白进行了相对定量分析。与传统的纳升流速相比，采用标准流速极大的提升了蛋白分析的稳健性及重复性，数据分析采用 MassHunter 结合 Skyline 完成。
靶向蛋白质组学结果成功证实了 IspA 突变的引入对单萜类化合物合成产量增加的决定作用。
图 2.靶向蛋白质组学定量表征通路中的关键酶
（CD2P：双质粒 DH1 菌株；CD*2P：双质粒 DH1 ispA 定点突变菌株；CD2P*：双质粒搭载 IspA 定点突变基因 DH1 菌株）
靶向代谢组学：采用安捷伦 LCMS 及 GCMS 对目标通路中关键的代谢物包括 GPP、FPP、中间代谢产物及目标终产物单萜类化合物进行了定量分析。
图 3. 1.8- 桉叶醇不同菌株改造的生产效率比较
（CD1p：单质粒DH1菌株；CD＊1P：单质粒DH1 IspA 定点突变菌株；CD2P：双质粒 DH1 菌株；CD*2P：双质粒 DH1 IspA 定点突变菌株；CD2P*：双质粒搭载 IspA 定点突变基因 DH1 菌株；CD*2P*：双质粒搭载 IspA 定点突变基因 DH1 IspA 定点突变菌株）
通过代谢组学分析证实了 GPP 和 FPP 的表达水平对单萜类化合物的合成均十分重要，后续通过合成生物学工程化的努力，实现了 653 mg/L 桉叶醇和 505 mg/L 芳樟醇的高效合成。
合成途径酶双表达与单表达质粒体系对终产物合成产率的影响
研究进一步比较了合成途径酶双表达与单表达质粒体系对合成产率的影响，发现双表达质粒体系能够取得更高的产量。进一步考察结合双表达质粒体系及法尼基焦磷酸合成酶突变菌株的优势的可行性，结果发现新构建的菌株因生长必要物法尼基焦磷酸的耗尽产生负向选择，导致整个合成途径的酶的极低表达。面临这个新的挑战，该研究团队通过在其中一个表达质粒载体中引入另一个突变的法尼基焦磷酸合成酶基因，从而实现了法尼基焦磷酸的重平衡，解决了菌株对异源表达途径的负向选择（图 3）。
本研究运用合成生物学技术对大肠杆菌进行通路及菌株改造，结合蛋白质组及代谢组对目标通路进行测量和分析，实现了桉叶油醇 653 mg/L 和芳樟醇 505 mg/L 的生物合成产率，比之前的报道产率分别提高了 30 倍和 5 倍之多。本研究构建的高产菌株为高价值单萜类化合物的生产具有重要的意义，同时也为组学技术在合成生物学中的应用提供了成功范例。
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