双水相体系逆流色谱技术在蛋白质分离中的应用

　　由于蛋白质产品在食品和营养品、药物、医学诊断及生物催化等领域的广泛应用，蛋白质的分离纯化方法的研究成为生物技术研究领域的热点。从传统的离心、沉淀、结晶方法，发展到双水相萃取[1]、反胶团萃取[2]、膜分离[3]、及各种色谱分离技术如凝胶色谱[4]、离子交换色谱[5]、亲和色谱[6]、疏水相互作用色谱[7]、逆流色谱[8]、以及电泳[9]等技术的应用。近年来，一些新型高效的蛋白分离技术如膜色谱[10]、连续环状色谱[11]、以及多种分离方法的集成联用技术[12~14]正在不断涌现出来。由双水相萃取技术与逆流色谱集成而成的双水相逆流色谱技术，结合了逆流色谱的高效率、高制备量以及双水相体系适于蛋白质分离的特点，且避免了由固体分离介质可能引起的不可逆吸附、失活和变性等问题，因此在蛋白质的分离方面具有独特的应用价值。本文就双水相逆流色谱技术和相关仪器的发展，以及近年来在蛋白质分离方面的应用进行了较为详细的综述，并对在此基础上发展起来的一些新型逆流色谱分离技术进行了介绍。

　　1双水相体系及逆流色谱技术 双水相体系(Aqueous two phase system，ATPS)是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解而形成的互不相溶的两水相溶剂体系。通过溶质在两相间分配系数的差异而进行分离的方法称为双水相萃取技术。最常用的体系有聚乙二醇(PEG)磷酸盐水溶液体系和聚乙二醇(PEG)葡聚糖(DEX)水溶液体系。双水相萃取技术自1955年由Albertson提出以来，在随后的几十年中，有了长足的发展。由于其具有易于放大，传质过程和平衡过程快速，易于进行连续化操作，分离过程和操作条件温和等优点，使其在许多生物物质的分离纯化中得到广泛的应用：如氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、以及各类细胞、病毒等，特别是成功地应用在蛋白质以及胞内酶的大规模分离中。

　　尽管双水相聚合物体系为蛋白质等生物大分子的分离提供了一个理想而温和的环境，并且可以实现连续分配操作。但是两相的高粘度和低界面张力使相分离时间延长，从而使两相分配的操作时间变得很长。在上世纪60年代，Albertson建立了一种薄层逆流分配设备，它能使聚合物体系在一个g的离心力场中实现多级分配。但是这种薄层逆流分配设备使分配过程需要经过混合、静置和流动相的转移等三个步骤才能完成，因此同样需要较长的分离时间。

　　上世纪80年代，美国国立卫生研究院(NIH)的Yoichiro Ito教授首先建立和发展了一种新型连续的液液分配色谱分离设备，称为逆流色谱(countercurrent chromatography，CCC)仪。 这种CCC仪器采用多层缠绕的螺旋管柱，由柱体的高速行星式运动产生的不对称离心力场实现两相溶剂体系的高效混合、分配及充分保留，从而实现物质在两相溶剂中的高效分离。通常将螺旋管柱的自转轴与公转轴平行，并且进行同向同步行星式运动的逆流色谱仪器称为J型CPC(coil planet centrifuge)， 如图1a所示[15]。这种J型CPC非常适合于采用含有机相两相溶剂体系对天然小分子活性成分进行分离，对含有机相两相溶剂体系的固定相保留可以达到 80%以上，在天然植物活性成分的分离中得到了广泛的应用。但是J型CPC对于高粘度和低界面张力的双水相聚合物体系的固定相保留较低(甚至低于 10%)，因此早期采用双水相聚合物体系在该CPC上进行的分离，效果一般都较差[16]。但是由于受到仪器条件的限制，至今仍有采用双水相体系在J型 CPC上进行蛋白质等分离的尝试[17~19]。2006, 26(2)李挺 等： 双水相体系逆流色谱技术在蛋白质分离中的应用

　　中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006

　　图1逆流色谱J型CPC(a)和正交轴X型CPC(b)示意图

　　Fig.1schematic diagrams of Jtype CPC(a) and Xaxis CPC(b)

　　进一步的研究发现[20,21]，采用自转轴和公转轴相互垂直的CPC，由于其在一定转速下能产生一个相对于径向离心力更加强大的横向力场，这种三维的不对称离心力场使得聚合物双水相体系的固定相保留得到显著的增强。在运转中，支持件保持着相对于仪器中心轴的不变的方位关系。因此，支持件的水平轴线同仪器的垂直轴线之间，始终保持一定的距离和正交关系。通常将这种逆流色谱仪器称为正交轴型CPC(X-CPC)，如图1b所示。根据螺旋管柱体与正交轴CPC的中心旋转轴之间的相对几何位置的不同，可以将正交轴CPC分为不同的型号，表示为XδL型，δ值越大表示螺旋管柱沿其轴线方向离中心轴越远，所受离心力越大。这种逆流色谱仪器适用于采用双水相体系进行生物样品中活性成分的分离制备。

　　2双水相体系正交轴逆流色谱技术在蛋白质分离中的应用双水相萃取技术的早期应用为采用双水相体系逆流色谱技术进行蛋白质等生物样品的分离和纯化积累了大量可选择的双水相溶剂体系。双水相聚合物溶剂体系的制备可以有两种途径：一是将两种亲水性聚合物以足够高的浓度溶解在一个水溶液当中，另一种是将一种聚合物加到一个含盐的缓冲溶液中。其中最为常用的是，聚乙二醇磷酸钾水溶液和聚乙二醇葡聚糖水溶液体系。前者构成的两相体系, 上相以聚乙二醇为主, 下相以磷酸钾水溶液为主;后者上相则以聚乙二醇为主，下相以葡聚糖为主。

　　目标成分如蛋白质在双水相聚合物体系中的分配系数由聚合物的分子量、离子强度以及缓冲溶液的pH值以及温度等决定。有时可以通过只改变溶液的pH值而保持溶剂体系的构成成分不变来获得理想的分配结果。小分子物质在双水相聚合物体系中的分配往往是单向性的, 要么溶解在上相中, 要么溶解在下相中。而蛋白质等生物大分子可以通过调整其在双水相中的分配系数使其接近整数, 而实现有效分离。

　　2.1聚乙二醇(PEG)磷酸钾体系

　　PEG和磷酸钾构成的双水相体系已被广泛应用于多种生物物质的分离。其中聚乙二醇使用最多的是PEG1000，其次是PEG8000和PEG1540。磷酸钾通常是由K2HPO4和KH2PO4构成的pH缓冲液，二者的比值决定构成的双水相体系的pH值。

　　2.1.1鸡蛋白蛋白的分离[22]鸡蛋白蛋白中主要含有卵转铁蛋白(ovotransferrin，Ot)、卵清蛋白(ovalbumin，Oa)、溶菌酶(lysozyme，Ly)和卵粘蛋白(ovomucin，Om)等4种蛋白。在XL正交轴CPC上采用16% PEG100012.5% 磷酸盐，pH =8.0的双水相体系，对新鲜的鸡蛋白蛋白样进行分离。卵转铁蛋白(Ot),卵清蛋白(Oa),溶菌酶(Ly)依据它们分配系数的顺序由下相即磷酸盐相作流动相分别洗脱出来,然后改用含PEG1000的上相作流动相将保留在柱中的卵粘蛋白(Om)以很快的速度从相反方向洗脱出来。整个分离在6小时内完成。

　　2.1.2细胞色素c、肌红蛋白、卵白蛋白和牛血红蛋白的分离[21]细胞色素c、肌红蛋白、卵白蛋白和牛血红蛋白是4种稳定蛋白质。 Shibusawa等在XLL型正交轴CPC上，采用由12.5% PEG100012.5% K2HPO4构成的双水相体系, 以下相为流动相，采用的分离柱是β为0.25~0.60的小柱, 转速750r/min, 流速2ml/min。由于牛血红蛋白在该溶剂体系中的分配系数太低，因此在前3种蛋白质细胞色素c(K=103.7)、肌红蛋白(K=2.08)和卵白蛋白(K=0.08)洗脱出来后, 换成富含PEG1000的上相为流动相, 从相反的方向将保留在柱中的牛血红蛋白快速洗脱出来。所有组分在5小时内完成分离。

　　2.1.3人血清中胆碱酯酶的分离[23]在XL正交轴逆流色谱仪上，采用16.0% PEG60012.5%磷酸盐体系，在pH 9.2的最优化条件下，用下相作为流动相，以0.5ml/min 洗脱柱，整个分离过程在2小时内完成。经SDS PAGE检测分析，胆碱酯酶已完全与血清白蛋白、α球蛋白、γ球蛋白分开。这样，一步就可以从人血清中分离纯化出胆碱酯酶。

　　2.2聚乙二醇(PEG)葡聚糖(DEX)体系

　　PEG和DEX体系对各种生物大分子都具有较高的溶解性, 从而避免了在PEG磷酸钾体系中由于较高的盐浓度造成的蛋白盐析现象。但是，PEGDEX体系两相的界面张力很低、黏度很高，容易造成乳化，使得其固定相在一般的正交轴CPC上的保留成为问题。采用XLLL和L型正交轴CPC以提高溶剂体系的固定相保留。

　　2.2.1α球蛋白与γ球蛋白混合物的分离[24]在大体积分离柱(300ml, β=0.451.50)的XLLL型正交轴CPC上，采用PEG和DEX体系分离94.5mg α球蛋白和107.3mg γ球蛋白的混合物, 溶剂体系为4.4% PEG80007.0% 葡聚糖T50010mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=6.8),以含PEG的上相(pH6.8)为流动相, 整个分离过程可在6小时内完成。

　　Shibusawa 等还在XLLL型正交轴CPC上成功地分离了组蛋白混合物、α球蛋白与人血清蛋白混合物，这些研究结果表明XLLL型正交轴CPC能够实质性地改善聚乙二醇葡聚糖体系的固定相保留，这显然是由于螺旋管柱体的侧向位移引起的。这些结果同时也提示我们，如果采用L型CPC，即R=0或L/R→∞能够进一步改善双聚合物体系的固定相保留。

　　2.2.2葡萄糖转移酶的分离[25,26]Yanagida等在XL型正交轴CPC(总柱体积145ml)上，采用含10mmol/L磷酸盐缓冲液的4.4% (w/w) PEG80006% (w/w) dextran T500 体系(pH 9.2)，上相即PEG相作为流动相，流速为1.0 ml/min，从生龋细菌的细胞溶解液中分离了葡萄糖转移酶。

　　2.3pH峰聚焦双水相逆流色谱技术[27]

　　pH峰聚焦逆流色谱(pHpeak focusing countercurrent chromatography)是通过在样品或固定相中添加一种合适的pH调节试剂(保留酸或碱)以产生一种峰的聚焦效应, 并延缓目标化合物的洗脱。这种方法最大的优点是样品能够在很小的体积内洗脱出来，峰尖，浓度较高，利于检测。这一技术除了可用于从粗样中分离和浓缩微量成分外，其最大的应用是在制备性分离方面。

　　从牛心脏组织中分离乳酸脱氢酶(LDH)，样品为3g牛心脏粗提物。在XL型正交轴CPC上采用15% PEG154015%硫酸铵体系，之所以选用硫酸铵是因为它能使溶液的缓冲能力降低。在上相中加入10mmol/L的乙酸作为保留酸，在下相中加入 100mmol/L NaOH作为洗脱碱, 下相为流动相。分离后做SDS凝胶电泳分析，结果显示在LDH的洗脱级分中(160~220mmol/L)，没有粗提物中其它蛋白质的残留，表明采用上述的pH峰聚焦CCC方法可以将LDH与牛心脏提取物中的其它蛋白完全分离。但是不可能将LDH的不同异构形式分离开来。这是首次有关采用pH峰聚焦 CCC方法从粗提物中快速分离目标蛋白的报道。

　　2.4染料-配体亲和逆流色谱技术[28]

　　早在上世纪60年代后期到70年代早期，染料配体亲和色谱法就已经被广泛地应用于各种蛋白质的分离。如果一种染料如汽巴或普施安能够单向性地分配在两相聚合物体系的任一相中，就可以形成染料配体亲和逆流色谱(dyeligand affinity CCC)，用于蛋白样品的分离。

　　从牛肝脏提取物中分离乙醇脱氢酶(ADH)的研究表明，在XL型正交轴CPC上，以0.05%普施安红为亲和配体的16% PEG100012.5%磷酸钾缓冲液(pH73)体系要比同样加了普施安红为亲和配体的44% PEG80007.0%葡聚糖 T50010mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.5)体系，更适于分离ADH(都是以下相为流动相)。这是首次报道采用染料配体亲和CCC技术从粗提物中分离目标蛋白成分。

　　3新型逆流色谱柱组件系统的应用3.1正交轴CPC上的螺线型管柱组件系统

　　正交轴CPC中，除了前面提到过的由于柱支持件相对于仪器中心旋转轴几何位置不同，形成不同的正交轴CPC外，还由于螺旋管柱缠绕方式的不同，可以构成不同形状的CPC柱体，这两种因素对双水相溶剂体系的固定相保留都有影响。前面所提到的螺旋管柱体基本上都采用标准的多层缠绕螺旋管柱(Multilayer coil)。

　　Shinomiya[29]等曾设计出两种新的螺线型管柱组件，如图2所示。将这两种新柱体与常用的缠绕螺旋管柱体装设于XL型正交轴CPC上，采用12.5% PEG12.5% K2HPO4双水相体系，下相为流动相,在相同的洗脱条件下，比较了两种新型螺线型柱体与常用柱体对双水相体系的保留能力以及对细胞色素C、肌红蛋白及溶菌酶等蛋白的分离能力。结果表明，两种新设计的螺旋管柱体与常用的标准螺旋柱对3种蛋白质的分离度基本相当，对固定相的保留能力比常用的柱体差，但是其理论塔板数/柱容量之比却是最高的。

　　这说明两种新型的螺线型管柱体可以用于双水相聚合物体系对蛋白质的分离，并且分离效果与标准的螺旋管柱相当。而且这种螺线型柱体的设计较标准的螺旋管柱有一个潜在的优势，就是可以通过在固体圆盘上刻槽的方式实现大量生产。然后将多层刻槽的圆盘重叠串连起来形成一个大体积柱体用于正交轴CPC上进行生物大分子的分离。

　　图2Shinomiya等设计的两种新型螺线型管柱组件

　　Fig. 2Two new spiral column assemblies

　　designed by Shinomiya

　　3.2J型CPC上的螺线型固体圆盘柱组件系统

　　如上所述，采用双水相体系正交轴逆流色谱技术可以实现对一些生物大分子物质的分离，但是相对而言，所产生的分离效率要比J型 CPC低，色谱峰也较矮较胖。

　　最近，Ito等[30,31]提出了一种新型的可用于J型CPC的柱体设计——螺线型固体圆盘柱组件系统。这种柱组件采用在固体圆盘上刻蚀螺线形槽体，通过增加螺距的方式，增强槽体内流动液体的离心力梯度，使得在J型CPC上即可实现对极性溶剂体系和双水相体系的固定相保留的极大改善，并保持了其高的分配效率。

　　初步的研究表明，将这种固体的圆盘柱体装设在J型CPC上，对12.5% PEG 100012.5% K2HPO4, 以及4%PEG8000-5%DEX T500-10mMNa2HPO4体系，都能在较高的流速下实现满意的固定相保留，并且随着螺距的增加，保留效果更好。尤其对于PEG—DEX体系，在合适的洗脱方式下，以DEX为主的下相固定相的保留最高可达70%以上。这是以前的螺旋管柱体设计即使是采用正交轴CPC也不能达到的。这种螺线型圆盘柱设计具有潜在的广阔应用前景。

　　4小结CCC由于其独特的优势近年来逐步发展成为一种备受关注的新型色谱分离技术，ATPS应用于CCC中成为双水相体系逆流色谱技术，它结合了两者的优点，在特殊的CCC仪器上可实现对生物大分子尤其是蛋白质等的有效分离纯化。目前，采用双水相体系ATPS对蛋白质等的分离主要是在正交轴型CPC上实现的。一些新型的CCC分离技术及新型CCC柱分离系统的出现使得ATPS在CCC仪器上的固定相保留以及对蛋白质等的分离效率不断地改善和提高，逆流色谱技术将在蛋白质等生物大分子的分离纯化中发挥更大的作用。

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　　The Application of Countercurrent Chromatography with Aqueous

　　Two Phase System in the Separation of Proteins

　　LI TingCAO XueliDONG Yinmao

　　(Beijing Technology and Business University, College of Chemistry and Environmental

　　Engineering, Beijing Key Lab of Plant Resource Research and DevelopmentBeijing100037, China)

　　AbstractAqueous two phase system(ATPS) provides a gentle, nondenaturing separation environment for proteins, enzymes. While highspeed countercurrent chromatography (HSCCC) is a liquidliquid partition chromatography which uses centrifugal force to hold the stationary phase and facilities the mobile phase partitioning through the stationary phase, it can produce high separation efficiency with large sample loading capacity. However, the ordinary HSCCC apparatus (Type J ) fails to retention a satisfactory stationary phase of ATPS because of its high viscosity and low interfacial tension. Nevertheless, the later designed crossaxis planetary centrifuge system(XCPC) can produce a greater lateral force field and enhances significantly the retention of the ATPS stationary phase. A review of the application of these CCC techniques with ATPS in the separation of proteins was given. Meanwhile, new techniques such as pHpeak focusing CCC and dyeligand affinity CCC and some new CCC column design for improvement of separation efficiency and retention of ATPS stationary phase are introduced.

　　Key wordsAqueous two phase systemCountercurrent chromatographyProtein separation