tRF & tiRNA实时定量PCR技术服务

      实时荧光定量PCR技术是在普通PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，zei后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。tRF & tiRNA是由tRNA切割产生，长度约15-45个核苷酸的小RNA。由于tRF & tiRNA长度太短，且与tRNA序列完全重叠，不能通过传统的实时定量PCR进行检测。本公司通过在tRF & tiRNA两端引入人工合成序列（adaptor），设计特殊的跨连接位点的定量PCR引物，可以精确检测微量样品中tRF & tiRNA表达水平。

图1. 双端接头法保证了tRF & tiRNA PCR产物的高特异性。

康成生物tRF & tiRNA实时定量PCR技术服务流程
1. 引物设计、合成
设计并合成目的tRF & tiRNA的特异性PCR引物。
2. 样品RNA抽提
a. 若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
b. 若实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
3. RNA质量检测
a．紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
b．甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
注：用于tRF & tiRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须高纯度、完整，没有RNase 污染（降解的样品不能用于实时定量PCR检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
4.RNA预处理（可选）
使用rtStar™ tRF&tiRNA Pretreatment Kit (Cat# AS-FS-005, Arraystar)进行预处理，去除3’氨酰基末端与3‘环***酸末端，***酸化5’羟基末端，并移去m1A, m3C等多种甲基化修饰。
注：tRNA上存在大量的转录后修饰，而且tRNA需与氨基酸形成氨酰基tRNA方可参与蛋白翻译。当tRNAs被切割为tRFs&tiRNAs时，这些修饰（包括甲基化修饰、氨酰基末端修饰）会全部或部分的保留下来。tiRNAs常由RNA内切酶Angiogenin切割产生，这类内切酶会在切割位点产生5‘羟基（5’-OH）末端与3’环***酸（3‘-cP）末端。然而，5’端与3‘端的接头连接步骤，需要底物小RNA 5’端为***酸，3‘端为羟基。此外，某些tRFs&tiRNAs的内部修饰比如m1A, m1G与m3C会严重阻碍反转录过程。因此为了准确检测tRFs&tiRNAs，这些修饰必须被有效的去除。

4. 逆转录合成cDNA
使用rtStar™ First-Strand cDNA Synthesis Kit (3’ and 5’ adaptor) (Cat# AS-FS-003, Arraystar) 试剂盒进行接头连接和反转,合成cDNA第一链。
5. 实时定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增，梯度稀释的标准同时进行实时定量PCR扩增，根据Ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中的内参，校正上样误差。
6. 分析结果、提供实验报告
分析实时定量PCR结果，根据标准曲线定量样品中的目的tRF & tiRNA。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途