扩增子测序是对特定长度的PCR产物或捕获的片段进行测序，分析序列中的变异。16S/18S/ITS等扩增子测序即通过提取环境样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的目标区域，通过检测目标区域的序列变异和丰度，以研究环境微生物多样性及群落组成差异。16S/18S rDNA为编码原/真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。ITS分为两个区域：ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。
实验流程图：

样本要求：Total RNA 10µg
案例展示：
1、各样品组的物种相对丰度柱状图

Alpha 多样性分析

Rank-abundance 曲线可用来解释多样性的两个方面——物种丰度和均匀度。在水平方向，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线越平缓，物种分布越均匀。


Rank-Abundance 曲线            alpha 多样性指数箱线图
4、Beta Diversity 是对不同样品的微生物群落构成进行比较分析。通过Beta-diversity分析可以直观地反映样本的差异情况。距离越远，微生物群落差异越大，即相似性越低。
  
    Unweighted UniFrac PcoA         weighted UniFrac PcoA 

β多样性箱形图
5、差异检验
物种间的差异分析可以通过OTU聚类的不同进行，从火山图，热图和曼哈顿图可以直观地表现物种间的差异。



                                                    差异OTU 火山图                                                                                                                                               差异OTU 热图
曼哈顿图
 

LEfSe分析根据分类学组成对样品按照不同分组条件进行线性判别分析, 从而能够在组与组之间寻找具有统计学差异的物种, 即对样品划分产生显著性差异影响的Biomarker 物种。

通过LDA得分图可直观的反应出不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的显著性。而物种分支进化图，由内至外辐射的圆圈代表了由门至属（或种）的分类级别。在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。

                   LDA 得分图                                                                                          物种分支进化图
 

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注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途