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【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨
【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨
蛋白新纯化思路探讨
思路:得到需要纯化的样品中所有杂蛋白的抗体,将这些抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上,然后再将需要纯化的样品过这个柱子,所有杂蛋白都结合在柱子上,目的蛋白穿透出来。
具体例子:原核表达蛋白纯化
1. 无目的基因的PET28a-BL21,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,将上清拿去免疫兔子,得到针对杂蛋白的抗体,将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上,命名这根柱子为X。PET28a-目的蛋白1-BL21诱导表达后,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,将上清过X柱,所有杂蛋白跟相应抗体结合,目的蛋白1穿透出来,实现纯化。
2. 无目的基因的PET28a-BL21,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,将沉淀拿去免疫兔子,得到针对杂蛋白的抗体,将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上,命名这根柱子为Y。PET28a-目的蛋白2-BL21诱导表达后,菌体超声破碎后离心分上清和沉淀,沉淀用尿素溶解,复性后过Y柱,所有杂蛋白跟相应抗体结合,目的蛋白2穿透出来,实现纯化。
问题肯定会有很多,我们课题组想尝试这样做一些,请大家给点建议,有哪些需要注意的地方,谢谢。
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最新回复
nn255 (2013-12-09 21:30:36)
glass (2013-12-09 21:31:00)
QUOTE:
哦 周期和成本 我现在暂时不会考虑 谢谢cocacola (2013-12-09 21:33:50)
个人觉得不是很实际,
1. 抗体的制备,以一个非常杂的蛋白混合物进行免疫,然后得到针对每一种抗原的抗体混合物?这个基本无法实现的,且后期的纯化、螯合也不是能理想化的达到预定目标;
2. 活化后各个基团的相互影响以及其结合能力的强弱,稳定性如何,这个恐怕很难保证。
3.退一步讲就算以上所说的都顺利,该柱子的层析效果也值得商榷,是否真的能如预设的一定把所有杂质都结合了?希望很小吧。基本无法实现使目标蛋白流穿的目的;
4.表达的结果不同批次间会有差别,成分也会有所不同,总不至于每一次要制备一个柱子吧。
5.使用不同系统,不同环境与条件的表达产物差别很大,使得这种方法无法像特异性吸附目的蛋白的方法有较广泛的应用(假设其可以用)。
vtongli (2013-12-09 21:34:14)
个人觉得不是很实际,
1. 抗体的制备,以一个非常杂的蛋白混合物进行免疫,然后得到针对每一种抗原的抗体混合物?这个基本无法实现的,且后期的纯化、螯合也不是能理想化的达到预定目标;
2. 活化后各个基团的相互影响以及其结合能力的强弱,稳定性如何,这个恐怕很难保证。
3.退一步讲就算以上所说的都顺利,该柱子的层析效果也值得商榷,是否真的能如预设的一定把所有杂质都结合了?希望很小吧。基本无法实现使目标蛋白流穿的目的;
4.表达的结果不同批次间会有差别,成分也会有所不同,总不至于每一次要制备一个柱子吧。
5.使用不同系统,不同环境与条件的表达产物差别很大,使得这种方法无法像特异性吸附目的蛋白的方法有较广泛的应用(假设其可以用)。
birdfish (2013-12-09 21:34:39)
个人觉得你的想法有些不切实际,举例如下
1、你既然能够制备抗体,为什么不制备目标蛋白的单抗,然后偶联到介质上,用来纯化目标蛋白。
2、能否得到抗所有杂质的抗体还需考证,且一些物质是不会产生抗体的,况且你连杂质都不知道有多少种,是什么成分。
3、自己偶联的亲和层析介质载量很低的,如果杂质量较大,即使产生抗体也会流穿,且杂质的含量各不相同,决定你必须先分析杂质都有什么,比例是多少。
4、本来很简单的试验为什么要设计的很复杂啊,两米的距离你非要向反方向走从地球的另一端到达目标。
但是楼主也有逆向思维的能力,学习了。并祝福楼主能够考虑大家的意见。
glass (2013-12-09 21:35:16)
QUOTE:
我导师的目的就是要让目的蛋白穿透 里面有特殊的目的亲和介质我们倒是自己买的 谢谢你的宝贵意见
dodoit (2013-12-09 21:35:48)
对于一些同源性比较高的蛋白,比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase,或者直接就是大肠杆菌的DNase,很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高,而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况,柱子上这么多种抗体,说不定有那个就和你的目的蛋白有其他的相互作用(比如疏水、离子键等)。
glass (2013-12-09 21:36:09)
QUOTE:
单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况,这个我倒是没有想到 谢谢koook5695 (2013-12-09 21:36:31)
觉得这个想法非常好,但是目前很难实施
一个是比较复杂,成本高,需要寻找更简便的方法
一个是纯化的纯度,只有理论上是成立的
skytree (2013-12-09 21:36:58)
我觉得楼主钱烧不完的话不如把序列给公司,几周就能拿到你要的东西了,而且比你的想法省钱
yyaxw84 (2013-12-09 21:37:56)
sepharose载量有限,一般破菌上清中杂蛋白起码占80%以上,要将每一种杂蛋白都挂住,那每个抗体需要挂多少在sepharose上?而且是每一个抗体都要有这么多的量,那总体来说这个sepharose上要挂多少蛋白?或者你可以加大填料的量来解决这个问题,但这个量将非常巨大。
而且蛋白纯化除了去除杂蛋白外,还有核酸、色素、多糖等很多成分要去掉,现有的Ni柱基本可以去除这些成分,但抗体柱可能就不行了。当然也可以通过后续的纯化去除,但如果大批量做的话,第一步的抗体柱纯化起不到浓缩样品缩小样品体积的作用,后面的离子交换还是凝胶过滤做起来就比较麻烦了
glass (2013-12-09 21:40:32)
QUOTE:
谢谢你的提醒 困难是有很多的 但是我觉得吧 可以作为一个纯化思路 或许不一定适合这个案例 但有可能其他方面有意义莲花白 (2013-12-09 21:43:12)
过程有些复杂,成本高
whitesheep (2013-12-09 21:43:40)
dreaming (2013-12-09 21:44:08)
standup (2013-12-09 21:44:30)
其实我也觉得这个想法不切实际,哈哈,楼主不要骂我哈,不过这个逆向思维是值得欣赏的
1 你用一个及其复杂的混合物(既有Ecoli的毒素,又含破碎细胞时用的去污剂,溶解蛋白时用的高浓度尿素或者盐酸胍)去免疫一只兔子,我首先想到的是这只兔子在产生抗体前能否保证活着,在国外估计是不允许拿动物做这种实验的
2 假设兔子活着,整个混合物中成分过于复杂,每种成分的免疫原性参差不齐,肯定会有某些杂蛋白的抗体水平相当低,根据水桶效应,你要去除所有杂蛋白必须保证抗体浓度最低的那个达到一定水平,这个量肯定需要实验来验证,但是肯定很大,绝对比你直接用目标蛋白免疫得到多抗或者做单抗要浪费得多
3 即使得到了所有杂蛋白的抗体,谁也没法保证这些抗体和你的目的蛋白没有交叉反应,就算第一次没有交叉反应,也无法保证每次都没有,也就是说这个实验是没法重复的,如此复杂的混合物中能和你的目的蛋白有交叉反应的可想不在少数,一旦有交叉反应,过柱子的时候必定是干干净净的全部留在柱子上,没有起到纯化的效果
4 做单抗的时候通常都需要筛选效价高,亲和力强的单抗,用这个混合物免疫得到的超级多抗中肯定合格的抗体是少数,最终亲和的效率肯定也达不到要求
这种实验还是建议楼主拿出一个可行的计划再动手,免得浪费时间和金钱,时间和经费多宝贵啊
biabiade (2013-12-09 21:45:03)
如果真的想这么做的话,应该用普通的层析方法,例如离子交换,将蛋白做一下初步纯化,减少一下体系的复杂性,再去做免疫尝试。
lyxsqs (2013-12-09 21:45:39)
没有用的,不是所有蛋白能引起足够强的免疫反应,也不是所有蛋白引起的免疫反应是体液的。
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