PacBio单分子测序揭示丹参叶绿体DNA修饰的相互作用
2014年6月10日，中科院药用植物研究所（IMPLAD）刘昶团队在《PLOS ONE》杂志上发表了利用PacBio测序技术揭示丹参（Salvia miltiorrhiza）叶绿体DNA修饰之间复杂相互作用的相关文章，该文章报道了丹参叶绿体中编码及非编码RNA的表达情况。这也是国内PacBio第三代测序用户在国际性杂志发表的第一篇文章。
丹参是最广泛使用的药用植物之一。作为基于叶绿体基因工程手段开发使丹参活性成分过表达方法的第一步，该研究团队从基因组，转录组，和碱基修饰三方面对丹参叶绿体进行了分析。先从新鲜叶片中提取总基因组DNA和RNA，然后进行链特异性RNA测序和 PacBio公司的单分子实时（Single-Molecule Real-Time, SMRT）测序分析。
实验先是将RNA测序得到的reads mapping到基因组，使该研究小组确定了80个蛋白质编码基因的相对表达水平。此外，还明确了19个多顺反子转录单元和136个假定反义和基因间非编码RNA（ncRNA）基因。将蛋白编码基因的转录本（cRNA）丰度与重叠反义非编码RNA（asRNA）相比较表明，asRNA的存在与cRNA的丰度增加有关（P<0.05）。使用SMRT Portal软件预测到了2687个潜在的DNA修饰位点和2个潜在的DNA修饰基序。两个基序包括TATA盒样基序（CPGDMM1, ''TATANNNATNA''），以及一个未知的基序（CPGDMM2, ''WNYANTGAW''）。
本文用二代和三代DNA测序技术并用，使在基因组层面研究非编码RNA和DNA修饰成为可能。然而，原来关于反义RNA和DNA修饰研究在实验上具有相当大的困难。首先，大多数asRNA转录本表达水平显著偏低，因而难以用经典技术如Northern Blot和原位杂交进行验证。第二，正义和反义转录本之间错综复杂的关系意味着实验扰动会不可避免地干扰其他转录本的表达。因此，通过knocking -in和knocking-out技术确定转录本的生物学功能是复杂的。第三，虽然SMRT技术已被证明能够检测到潜在的DNA修饰，但验证这些修饰仍然是个挑战性的任务。第四，叶绿体asRNA和DNA修饰的存在和功能的验证是更加困难的。
综上所述，本研究所描述的一些发现从目前的技术上来讲是有巨大进步的。然而，本研究提出的数据已经证实了由asRNA和DNA修饰引起的基因表达调控的复杂性。
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