十字交叉连续稀释分析法确定包被试剂和碱性磷酸酶-抗体结合物的最适浓度，标准抗原溶液（包被试剂）和结合物（显色剂）浓度各不相同（见辅助方案）。用封闭缓 冲液稀释结合物，配制浓度为最适浓度（通常为 25〜500ng 抗体/ml) 2倍（2 X ) 的结合物溶液。每个滴定板需3 ml 结合物溶液。
用 50ul 标准抗原溶液包被 Immulon 微量滴定板，并封闭（见基本方案，步骤 2〜5)。
为了绘制标准抑制曲线（步骤10)，用封闭缓冲液对标准抗原溶液做连续 6 次1 : 3 (V/V)的稀释（见辅助方案）。应使用抑制作用动态范围大（15%〜85%，通常是 1〜250ng/ml)的若干稀释度，每个滴定孔每个稀释度需 75ul 以上。
抑制作用动态范围在最初的实验里以经验确定，抗原浓度一般在 10 ~ 6 mol/L和 10—12mol/L范围内变动。对于大多数蛋白质抗原，初始浓度应在IOug/ml 左右，用 封闭缓冲液以 1:4 (V/V)连续稀释 9 次，在标准检测条件下检测这些抗原稀释液 抑制结合物与抗原包被滴定板结合的能力。
圆底或锥底微量滴定板每孔中加入 75ul 2X结合物溶液，而后加入 75ul 抑制剂[待 测抗原溶液或者是标准抗原溶液（步骤 3)]，混合孵育。将等体积的 2X结合物溶液 与封闭缓冲液混合配制成未抑制的对照样本，用微量移液管上下混匀3次后，于室 温下孵育 > 30 min。如需要，测定待测溶液的 2〜3 个稀释度，以期在 15%〜85% 范 围内产生抑制作用。
转移 50ul 结合物与抑制剂的混合液或对照样本到一抗原包被的滴定板上（步骤 2)。 对照样本放在第 11 列；单纯底物溶液（无结合物）放在第 12 列。如要测复份样品， 则将其放入同一块板的相邻一列中。如需精确定量分析，每块板上应含有同源抗原 溶液的不同稀释液（步骤 3)，于室温下孵育 2 h。
洗涤滴定板（见基本方案，步骤 7)，每孔中加入 75 ul MUP 或 NPP 底物溶液，室温 下孵育 1h。
至少 1h 以后，无抑制反应中的底物充分显色，可用微量滴定板检测仪精确测量抑制 作用。
基于标准抗原溶液稀释液抑制作用绘制标准抗原-抑制曲线，抗原浓度对数值为 X 轴，焚光度或吸光度为：y 轴。
用内插法在标准抗原抑制曲线中求出待测溶液中抗原浓度。线性偏差表明特异性抗 体是异质性的，有明显不同的亲和力，或可能是配制的标准抗原溶液含异质性抗原。
