抗体或蛋白质中硫基的引入实验
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 实验所需「试剂」具体见「其他」 在氮气条件下,每 1 ml 抗体或蛋白质溶液加入 0.1 ml AMSA 溶液,密封试管并在室温下缓缓搅拌 0.5 h。为移除乙酰基并暴露硫醇基团,需加入溶于 0.1 mol/L pH 7.0 Tris-HCl 的 0.2 ml 0.5 mol/L 羟胺、0.01 mol/L EDTA,调整至 pH 7.0。30℃ 放置 4 min。将混合物过柱(交联葡聚糖)并用 0.1 mol/L pH 6.0 的磷酸二氢钾及 5 mmol/L EDTA 洗脱。收集蛋白质组分(280 nm 下测定吸收值)并通过超滤浓缩至 1 ml。 |
注意事项 | |
其他 | 试剂: AMSA 溶液(S-乙酰疏基丁二酸酐;Mr=174.2;60 mg 溶于 1 ml N,N'-二甲基甲酰胺) 0.1 mol/L 磷酸二氢钾,pH 7.0 抗体或蛋白质溶液(IgG,10 mg/ml 溶于 0.1 mol/L 磷酸二氢钾,pH 7.0) 氮气 0.5 mol/L 羟胺(NH2OH·HCl,Mr=69.5),0.01 mol/L EDTA(Mr=292.3)溶于 0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.0(3.46 g NH2OH·HCl,0.29 g EDTA 溶于 100 ml 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸二氢钾) 交联葡聚糖 G-25 色谱柱,约 1.5 cm×30 cm,用 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸二氢钾平衡 5 mmol/L EDTA |