ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) :是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面,使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体。
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA)。
在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
1、间接ELISA
本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎(DVH)抗体的ELISA为例,间接ELISA的操作程序如下:
(1) 材料
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;
② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清;待检鸭血清;
③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 30分钟,加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值,并计算出P/N比值。
(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知阳性血清的OD值≥0.4;在上述条件成立的情况下,如果待检血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待检血清的OD值≥0.4,则判为阳性,否则判为阴性。
2、双抗体夹心ELISA
本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 15分钟,加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
3、双夹心ELISA
此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于:它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原,它不仅不必标记每一种抗体,还可提高试验的敏感性。
此法的基本程序为:
① 加抗体(Ab-1)包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检抗原(Ag) → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(Ab-2)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
④ 加入酶标抗Ab-2抗体(AB-3)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。