LC-MS/MS检测乳粉中的双酚A
图1. 2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，俗称双酚A（BPA）。
双酚A（BPA）被广泛应用于食品、饮料包装的生产中，摄入BPA会对人体尤其是婴儿的健康造成一定的伤害。本文介绍了通过TurboFlow技术与TSQ Vantage三重四极杆质谱技术联用，自动分析多个样品，且能快速、灵敏地检测BPA的方法。
双酚A（BPA），即2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，是生产塑料的主要原料之一，也被大量用于食品、饮料包装的加工。由于BPA能从食品金属包装的塑料内层浸出，因此与之接触可能带来的潜在危害备受人们关注。研究表明，摄入较高剂量的双酚A可导致心脏病、糖尿病和肝酵素过高；而婴儿接触极低浓度的BPA也可能受到伤害。美国环保署规定BPA的最高摄入量不得超过50 μg/kg/天。目前，测定食品中的BPA含量主要应用液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术。
测定罐装婴儿配方奶粉中的BPA含量，其样品前处理需进行复杂的萃取步骤，如固相萃取、溶剂萃取和微萃取技术，同时还需使用合适的溶剂进行浓缩和制备样品。不仅耗时较长，人工操作的误差也会导致结果不稳定。
研究人员在负离子大气压化学电离（APCI）模式下，采用氘化内标物（BPA-d16）开发了一种测定乳粉中BPA含量的LC-MS/MS方法，该方法采用了自动样品前处理技术，全程历时约6min。
图2. 浓度为LLOQ 0.78 ng/ml（左）和ULOQ 100 ng/ml（右）的BPA H-SRM m/z 133离子对（上）和BPA-d16（下）的色谱图对比。
检测双酚A的实验
样品前处理
用于制备空白、QC和标样的婴儿配方奶粉购自马萨诸塞州当地超市，瓶盖涂有低密度聚乙烯，瓶身材料为聚酯纤维；BPA和BPA-d16购自密苏里州圣路易斯；稀释液（AmAcACN溶液）为含3%醋酸铵的乙腈-水（70:30，v/v）溶液；使用AmAcACN溶液配制BPA工作液，浓度为10 μg/ml。
配制婴儿配方奶粉溶液，在1g婴儿配方奶粉中加入10ml AmAcACN溶液，并在10000 RPM转速下离心30min。取上清液稀释配制成一系列浓度的BPA标样和QC标样，分别加入25ng/ml的BPA-d16内标物。标样浓度范围为0.78~1000 ng/ml,进样体积为25μl。
实验方法
萃取液的净化通过在TLX-1 LC系统上运行TurboFlow方法来完成，萃取柱为TurboFlowCyclone P聚合物柱。在上样步骤中，大分子直接进入废液中，目标分析物则进入萃取柱中。用有机溶剂洗脱进入到HypersilGOLD aQ封端硅胶C18反相色谱柱中，通过梯度洗脱进入到带有APCI源的TSQ Vantage MS中。在负离子电离化模式下，监测BPA母离子m/z 227>133和212的高分辨率选择反应监测（H-SRM）离子对。BPA的子离子133 m/z用于定量分析，子离子212 m/z用于验证。由于BPA-d16在水中会转化成BPA-d14（MW 242），BPA-d16监测的是母离子m/z 241>223的H-SRM离子对。LC-MS/MS方法的总运行时间为5.6 min。
图3. 基于BPA标样与内标BPA-d16峰面积比值的BPA线性回归曲线。
AriaTMTLX-1系统参数
TurboFlow Cyclone P色谱柱（0.5× 50mm）；Hypersil GOLDTM aQ（4× 50mm，3μm粒径）。
上样泵流动相
流动相A，10mM碳酸氢铵pH10；流动相B，含0.1%甲酸的乙腈溶液；流动相C，丙酮：乙腈：异丙醇(20:40:40 )。
图4. 婴儿配方奶粉基体中预空白（左）和后高空白（右）的BPA H-SRM m/z 133离子对（上）和BPA-d16（下）的色谱图对比。
洗脱泵流动相
流动相A：水；流动相B：甲醇。
MS分析在TSQ Vantage三重四极杆质谱上进行，MS条件如表1所示。
整个实验由Aria操作软件1.6.2控制，采用Xcalibur 2.0.7 SP1数据系统软件扣除背景后，用LCQUAN 2.5.6定量软件进行数据处理。
图5. 基体加标12.5 ng/ml（A），水加标12.5 ng/ml（B），基体加标25 ng/ml（C）和水加标25 ng/ml（D）样品中的BPA H-SRM m/z 133离子对（上）和BPA-d16（下）的色谱图对比。
结果与讨论
由于BPA存在于空气（2~208 ng/m3）、灰尘（0.2~199ng/g）、水（5~320ng/L）
等各种来源中，因此很难在实验室获得真正的BPA空白。为此，研究人员使用XcaliburTM系统的内置软件扣除所有定量数据中的标准双空白峰。BPA和BPA-d16在定量检出下限（LLOQ，0.78 ng/ml）和上限（ULOQ，100ng/ml）浓度下的色谱图见图2。应用LCQUANTM2.5.6数据定量软件处理数据，BPA的基体匹配校准曲线在2个数量级浓度范围内为线性，相关系数r2=0.9921（见图3）。校准曲线上LLOQ浓度点的%CVs（n=3）小于20%，其他数据点小于10%。预空白和后高空白（扣除前）的对比说明其区别可以忽略（见图4）。基体的干扰通过比较相同浓度BPA加标到基体和水中的色谱图进行评估，12.5ng/ml和25ng/ml浓度下的对比如图5所示，由此判断基体的干扰是很小的。
小结
本文介绍了一种快速、灵敏且样品前处理自动化的LC-MS/MS方法，能够筛选、测定婴儿配方奶粉中浓度为7.80μg/kg（ppb）干奶粉（检出限）的BPA，并定量测定浓度为31.3μg/kg（ppb）干奶粉（LLOQ）的BPA（背景调节后）。与离线液/液或固相萃取相比，TurboFlow在线样品前处理技术更卓越、快速。此外，LC-MS/MS方法的运行时间仅为5.6min，且样品通量在Aria TLX-2（或TLX-4）系统上还能提高。
