培养皿高压蒸汽灭菌效果不佳的原因探讨
高压蒸汽灭菌是微生物实验常用的灭菌方式，定期监测高压蒸汽灭菌效果是微生物实验室质量保证体系中重要的组成部分。一般来说，培养皿洗涤晾干后先用高压蒸汽灭菌，然后再在烘箱中烘干，冷却后即可用于微生物实验。这个过程高压蒸汽灭菌是确保检测质量的关键，而烘烤也可起到辅助灭菌的作用。
前段时间，在做菌落总数检测时发现有些平板计数琼脂底层有水膜状，边缘不整的菌落生长，培养基边缘也有菌生长，而培养基表面却未见菌落总数异常。经过多方面排查原因，发现培养皿高压灭菌效果不佳为可能主要原因。为了探讨真正原因，规范微生物实验室各种实验器材消毒灭菌操作，保障微生物检测质量，特设计此实验进行分析研究。
1 实验材料、设备及方法
1．1 实验材料
平板计数培养基购于北京陆桥技术有限公司，Sterikon plus生物指示剂购于广州泽元贸易有限公司，玻璃培养皿等实验器材实验室自备。
1．2 实验方法
1．2．1 高压蒸汽灭菌 以数显温度指示为准，121℃、15 min。
1．2．2 灭菌效果评价 参照GB15981—1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准，Sterikon plus生物指示剂放置于电热压力蒸汽灭菌器内不同地方，高压蒸汽灭菌后取出，再与未消毒的生物指示剂于60℃，培养24 h。通过颜色变化来评价灭菌效果。
1．2．3 平板计数 参照SN0168—92标准，培养皿样品准备后加入约15 ml平板计数琼脂，凝固后倒置，于37℃，培养至一定时间，观察结果并记录。
1．2．4 样品准备 A 系列培养皿：金属平皿简装，垂直放置于电热压力蒸汽灭菌器，从上至下编号A01～A10，其中A05培养皿内放入一支生物指示剂，121℃消毒15 min。冷却后取出。
B 系列培养皿：采用牛皮纸包裹，垂直放置于电热压力蒸汽灭菌器，从上至下编号B01～B10，其中A05培养皿内放人生物指示剂。121℃消毒15 min。冷却后取出。
C 系列培养皿：金属平皿简装，垂直放置于电热恒温干燥箱，从上至下编号C01～C10，其中C05培养皿内放人生物指示剂。160℃消毒120 min，冷却后取出。
同时，在电热压力蒸汽灭菌器上、中、下部裸露各放一支生物指示剂。
平板计数培养基、稀释用水、吸管等实验用具一并于电热压力蒸汽灭菌器121℃消毒15 min。冷却后取出。
A、B和C 系列中的2、4、6、9号培养皿，取出后倒入同锅消毒的平板计数培养基约15 ml，37℃培养，至一定时间后取出观察结果。
A、B和C 系列中的1和7号平板直接倒入同锅消毒的稀释用水(225 ml／瓶)约1 ml。加入同锅消毒的平板计数培养基约15 ml，37℃培养，至一定时间后取出观察结果。
A、B和C 系列中的3和8号平板用吸管吸取同锅消毒的稀释用水(225 ml／瓶)1 ml。加入同锅消毒的平板计数培养基约15 ml，37℃培养，至一定时间后取出观察结果。
A10、B10和C10培养皿倒人消毒已2周的试管装稀释用水(9 ml／管)1 ml。加入同锅消毒的平板计数培养基约15 ml，37℃培养，至一定时间后取出观察结果。
A05、B05培养皿内的生物指示剂，灭菌后取出于60℃，培养24 h。C05培养皿内的生物指示剂，灭菌冷却后取1 ml涂布予营养琼脂平板中于60℃，培养24 h。
2 结果与讨论
细菌培养基和所有用于分离、保存菌株的容器及用于细菌学研究的仪器设备都要灭菌，并通过细菌学检测法证实灭菌操作的有效性。微生物实验室常用的灭菌方式有干热灭菌和湿热灭菌两种方式。其中压力饱和蒸汽灭菌(高压灭菌)是对实验材料进行灭菌的最有效和最可靠的方法，它能对所有在高温下不分解的培养基进行灭菌。它还适用于对玻璃器皿、仪器和标准菌株及其他污染物洗涤前的灭菌。
对于大多数目的，下列组合可以确保正确装载的高压灭菌器的灭菌效果：134℃、3 min；126℃、10 min；121℃、15 min；115℃、25 min。干热灭菌采用160℃、2 h；170℃、60 min；180℃、30 min。
121℃，15 min是高压蒸汽灭菌常用的灭菌条件。如今，微生物实验使用的大部分是商业培养基，多数要求灭菌条件是121℃，15 min。为了便于工作，实验室常采用培养基与器皿同时灭菌。这要求实验人员加强所有灭菌物品灭菌效果的监测，以满足微生物检测质量要求。
生物监测是使用活的微生物制成的指示剂，它根据微生物的死亡情况来判断灭菌是否成功，这是确定压力蒸汽灭菌是否有效的最可靠方法。从生物指示剂监测高压灭菌锅的结果(如表1)可知，裸露和纸包裹培养皿样品灭菌效果良好，而金属平皿筒装培养皿内的灭菌效果不彻底。
从表2结果可知，B2、B4、B6、B9及C2、C4、C6、C9样品37℃培养48 h均未出现菌落生长，从而可知，此电热压力蒸汽灭菌器适用于培养基、用纸包装培养皿的灭菌。
C 系列样品平板计数结果表明，采用金属平皿筒装培养皿于电热恒温干燥箱中160℃、2 h可达到灭菌要求。生物指示剂平板涂布试验未发现有菌落生长，也证实了电热恒温干燥箱的灭菌效果。
B1、B3、B7、B8、B9、B10及C1、C3、C7、C8、C9、C10样品37℃培养48 h均未出现菌落生长，从而可知，此电热压力蒸汽灭菌器适用于稀释用水的消毒，而且在室温条件下可保持2周。同时也适用于吸管的消毒。
A系列培养皿从上到下，灭菌效果不同，金属筒上部的灭毒效果尚可，中下部的培养皿经检测，均有不同程度的细菌生长，且生长的情况与实际工作出现的相符，这表明，造成培养基底层有水膜状，边缘不整的菌生长，培养基边缘有菌生长的根源是金属筒装培养皿在电热压力蒸汽灭菌器内121℃、15 min消毒效果不佳。这些结果与采用生物指示剂评价的结果一致。
高压灭菌锅内的实际温度取决于蒸汽压力。高压灭菌常采用的纯饱和蒸汽压为103．4 kPa、121℃、15～30 min灭菌。固定灭菌温度下的灭菌时间取决于以下因素：放人的灭菌物质和污染物的特性；容器的体积和壁的厚度；内容物的特性等。
金属平皿筒装培养皿在消毒过程中，由于筒内的空气不易排除，特别在筒下部，滞留的空气阻碍有效的热传递、热交换效率，因而可致筒下部的培养皿内达不到121℃，或者达到121℃，却未维持15 min。纸包裹由于纸的透气性较好，排气充分，热传递和交换效率高，因而培养皿能达到灭菌效果。
干热消毒与湿热消毒比较如表3，在同等温度下，湿热灭菌效果较好，但在金属筒内部滞留的空气可形成类似干热消毒的情况，因而金属筒中装的培养皿无法达到良好灭菌效果。
为了进一步证实金属筒装培养皿用高压灭菌锅121℃、15 min灭菌效果，采用延长灭菌时间至25 min和改用手提式高压灭菌锅的方法进行实验，其灭菌效果仍不理想(实验数据未列出)。这表明，对于这台消毒设备，在121℃、15 min灭菌条件下，培养皿不适合采用金属平皿简装进行灭菌。
3 小结
微生物实验室应该根据自身已有的设备条件，积极调整自己的操作，通过实验验证，在满足微生物实验要求的基础上，选择适合的操作方法，并加以规范、统一实验室人员的操作，建立本实验室的工作细则。
从实验可知，该立式自动电热压力蒸汽灭菌器能够满足培养基、稀释用水、吸管等灭菌要求，培养皿则应选择干热灭菌，灭菌条件为160℃、2 h，特殊情况下也可采用纸包装的形式进行高压灭菌。同时，日常工作中应加强高压灭菌效果监测。
加强微生物实验室的质量控制，对于实验出现的问题，应及时系统地分析，尽快找到问题所在，使实验室运行重新步人正轨。
