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婴幼儿奶粉双氰胺检测- 默克色谱柱快速解决方案
ZIC®-HILIC色谱柱快速检测婴幼儿奶粉中双氰胺
默克密理博应用实验室 2013-01-29
1 前言
2013 年1 月，新西兰牛奶及奶制品被检测出含有低含量的有毒物质双氰胺(二氰二氨Dicyanodiamide，DCD)，已经下令禁售含有DCD的奶制品。中国的进口奶粉八成来自新西兰，全球60%以上的奶源产自新西兰。新西兰奶农通常会在牧草上喷洒双氰胺，防止肥料中的副产品硝酸盐流入河流和湖泊。
目前，还没有相应的食品含量标准和检测标准。默克密理博致力于分析方法的开发，为客户提供简便、快速的解决方案。双氰胺极性较强，易溶于水，中性及酸性条件下易电离，适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用(ZIC®-HILIC)色谱柱分离。同时，双氰胺在218nm下有强紫外吸收，可以采用ZIC®- HILIC 色谱柱在HPLC-UV条件进行快速分析，亦可在LC-MS/MS进行痕量检测。
2 仪器及试剂
2.1 仪器设备
2.1.1 色谱柱：ZIC®-HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 μm, 200 Å(1.50458.0001)
2.1.2 HPLC：Agilent 1260HPLC(DAD检测器)
2.1.3 单道移液器Transferpette®S，Digital adjustable 500-5000ul(Brand：BR704782)
2.1.4微孔滤膜:0.45um,PTFE(Millipore：SLFHX13NL)
2.1.5纯水系统:Milli-Q3(Millipore)
2.1 仪器设备
2.1.1 色谱柱：ZIC®-HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 μm, 200 Å(1.50458.0001)
2.1.2 HPLC：Agilent 1260HPLC(DAD检测器)
2.1.3 单道移液器Transferpette®S，Digital adjustable 500-5000ul(Brand：BR704782)
2.1.4微孔滤膜:0.45um,PTFE(Millipore：SLFHX13NL)
2.1.5纯水系统:Milli-Q3(Millipore)
2.2 试剂
2.2.1色谱乙腈:LichroSolv®Acetonitrile Gradient Grade(1.00030.4008)
2.2.2乙酸铵：Ammonium acetate for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur(1.01116.1000)
2.2.3甲酸：Formic acid 98-100% for analysis EMSURE® ACS,Reag. Ph Eur(1.00264.1000)
2.2.4 2%甲酸溶液：取20ml甲酸，加入1000ml超纯水中
2.2.5 70/30乙腈-甲酸溶液：去700ml乙腈(2.2.1),与300ml 甲酸溶液(2.2.4)混合
3 实验方法
3.1 样品处理
方法1:
取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中，加18mL 2%的甲酸水溶液，加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，放入离心机中离心(4000转)，20分钟。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加盖密闭，振摇60秒，吸取溶液，过滤，即得供试液。
方法2：
取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液，加盖密闭。摇振60秒，再超声30分钟，取出，再摇振60秒，静置，吸取上层溶液，过滤，即得供试液。
加标样品同法配制。
3.2 测试条件
3.2.1 色谱条件
流动相 (v/v): A-醋酸铵溶液(10 mM),B-乙腈
比例*：A:B=12：88
流速:1 mL/min
进样量：20ul
*必要时设置如下方法对色谱柱进行再生和平衡：
| 时间，min | % | % | 流速 ml/min | |
| 0 | 12 | 88 | 1 | 等度 |
| 10 | 12 | 88 | 1 | 等度 |
| 10.5 | 30 | 70 | 2 | 再生 |
| 15 | 30 | 70 | 2 | 再生 |
| 15.1 | 12 | 88 | 2 | 平衡 |
| 20 | 2 | 88 | 2 | 平衡 |
3.3 测试结果
按照方法1处理，结果如下：
3.3.1 对照品图谱
(DCD浓度1.25ug/ml)
双氰胺保留时间4.98min,理论塔板数13086,拖尾因子1.2.
3.3.2 无检出的奶粉空白
3.3.3 奶粉加标
测试液中加入的标样浓度:5ug/ml
测试液中加入的标样浓度：0.05ug/ml.
3.3.4 某知名品牌奶粉
该品牌奶粉中未检出双氰胺.
4 结论
采用ZIC®-HILIC色谱柱，可用于双氰胺的快速检测。处理方法简单，色谱峰型良好，方法重现性良好(RSD<2%),检测浓度在 0.5-10ug/ml之间现行关系良好(R=0.999),加样回收率在95.6-101.5%之间。按照方法1的处理，LOD为1.3ug/g奶粉，按照方法二处理,LOD可达0.07ug/g。
该色谱柱还能用于三聚氰胺、双氰胺、三聚氰酸、二甲双胍、尿素等的同时检测，如：
另外，LC-MS/MS采用如下色谱条件：
色谱柱：ZIC®-HILIC (5 µm, 200Å) PEEK 150x2.1 mm
流动相：A: 95:5 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O
B: 50:50 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O
梯度方法
| Time (min) | Solution A (%) | Solution B (%) | Flow rate (mL/min) | Elution |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 | 0.400 | isocratic |
| 5.0-12.8 | 100-25 | 0-75 | 0.400 | gradient |
| 12.8-15.8 | 25 | 75 | 0.400 | isocratic |
| 15.8-16.0 | 100 | 0 | 0.400 | equilibration |
| 16.0-24.9 | 100 | 0 | 0.600 | equilibration |
| 24.9-25.0 | 100 | 0 | 0.400 | equilibration |
