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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-12-01 11:04 作者: youyou99 来源: 分析测试百科网
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原帖由 555444 于 2014-12-1 11:04 发表 这个应该是不同的样本吧,来源一样吗?虽然模板浓度一样,但是同个基因在不同样本中的表达不一样的,同时在不同样本中同个引物也有不同的产物,我觉得可能是某几个样本中该基因表达过少,或者样本中有其他干扰因素。 ...
原帖由 qqq111 于 2014-12-1 11:07 发表 我觉得这个和浓度没多大关系吧,你每个样都用Actin做内参已经排除浓度所造成的误差了。有可能是引物二聚体或者设计的引物特异性不。是不是你的样品可以大概分为两个群体,或者你的基因是个家族,这个可能性应该不大吧? ...
原帖由 小游abc 于 2014-12-1 11:04 发表 这张图中较高的峰的峰行还不错基本是单峰,主峰较小的那个有小峰有两种可能,要么是非特异性扩增,要么是引物二聚体,如果出峰时间过早的话应该是引物二聚体,要是与主峰相伴而出的话应该是非特异性扩增,后者的话可以提高一下镁 ...
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小游abc (2014-12-01 11:04:30)
555444 (2014-12-01 11:04:56)
leifengta (2014-12-01 11:06:07)
有双峰的应该是样本RNA提取时不纯还有基因组DNA或者是非特异扩增,因为明显变性温度较主峰高。设计引物是可以考虑跨外显子。弥补的方式可以用DNA酶消化DNA。
qqq111 (2014-12-01 11:07:42)
我觉得这个和浓度没多大关系吧,你每个样都用Actin做内参已经排除浓度所造成的误差了。有可能是引物二聚体或者设计的引物特异性不。是不是你的样品可以大概分为两个群体,或者你的基因是个家族,这个可能性应该不大吧?
youyou99 (2014-12-01 11:08:13)
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是6个模板,每个模板做了3个重复youyou99 (2014-12-01 11:19:40)
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我的6个模板确实是两组,每组三个模板 每个三个重复,但即使是不同组 他也应该是单峰啊?youyou99 (2014-12-01 11:19:58)
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呃,我是初学定量的。出蜂时间怎么看啊?退火温度的话,已经选了摸索梯度的最高温度了,还能提高吗?whitesheep (2014-12-01 11:20:38)
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这种非特异性扩增就分三种,一种是针对你提到的寄主或者基因组,另一种是寄生虫的总基因组。可以对引物针对寄主总mRNA及总基因组做一个primer blast,以看是否有非特异性扩增。基因组的话可以通过RNase-free的DNase处理,但是如果是因为寄主mRNA污染造成,估计只能通过重新设计引物来解决。
utt0989 (2014-12-01 11:21:08)
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有可能是你设计的引物正好对另一个群体特异性不好,家族的突变位点有的时候还是蛮多的
shenkunjie (2014-12-01 11:21:34)
wood533 (2014-12-01 11:21:53)
【求助】定量 pcr曲线分析