应用高分辨率LC-MS分析复杂样品
在高度复杂的样品，如食品提取物，动物饲料，农药，真菌毒素和兽用药品中确定和量化分析物是质谱分析中的一项重大的挑战。准确筛检这些样本在环境监管，如食品和动物饲料的分析中至关重要。
三重四极杆质谱仪已在这些实验中有所应用，然而这种方法有一些局限性，包括在数据采集完成后无法重新质询数据，无法检测未知化合物以及每次分析只能检测有限的化合物。飞行时间(TOF)质谱仪也被应用于这一领域，但该技术的分辨率较低(15000)导致质量测量受到背景基质干扰而不准确。
越来越多的成功实验已经表明，有能力实现高分辨率LC-MSn质谱分析对于实现高度复杂样品检测中准确的质量分析、元素成分分析及确定、和非常专化的定量分析是关键性的。
虽然高分辨率质谱的优势已经很明显，科学界对于如何建立质谱高分辨方法仍然有相当大的分歧。本文将试图澄清在高分辨率质谱领域应用的术语，技术和方法，并通过一个简短的案例来深入的阐释高分辨率LC-MSn的应用。
定义“高分辨率”
高分辨率技术在质谱领域和摄影领域的应用在本质上是相同的：高分辨率照片能显示出更多细节，而低分辨率照片则一片模糊。然而，“高(质量)分辨率”和“准确质量”往往被(不正确)的混用了。高分辨率对于不同峰的分离是非常必要的，并确保在某个特定测量中只有同种离子。而被测量的参数既可以是精确的质量也可以是高度专化的数量。
高分辨率在涉及复杂混合物的实验中格外重要，例如一些从某种基质中提取的样品(如生物或环境样品)。因为这些样品中通常会包含大量的背景离子，在这种情况下，高分辨力将使结果大大不同。例如，能否在同位素基质的掩蔽效应干扰下依然检测出低浓度的分析物。
由于“分辨率”和“分辨能力”这两个词被用来描述质谱仪，看看他们的定义是很有必要的。
国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将质谱的“分辨能力”定义为：
区分质核比之差非常小的离子的能力。这种能力可用其在两处的峰宽来表征—具体为在百分之五十和百分之五最大峰高处的峰宽， 峰宽则以质量单位测量，表达为质量的函数。
国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将质谱的“分辨率”定义为：
百分之十峰谷定义：若质量分别为m和m-Dm的两个等高的峰由一个峰谷分开，且该峰谷的最低点为任何一峰的百分之十。而对于质量大于m的类似的高峰， 峰谷的最低点大于(以任何数量)任何一峰的10%， 则分辨率为m/Dm. m/Dm之比应以m的倍数表示。
峰宽定义：对于质谱图中一个由质量为m的单电荷离子组成的单峰，分辨率可以用m/Dm表示。 其中Dm为指定峰高处的峰宽。建议为百分之五十最大峰高处，百分之五最大峰高处或百分之零点五最大峰高处三者之一。对于一个孤立的对称峰， 若某种记录系统的线性范围在百分之五和百分之十的峰高处之间，那么百分之五峰高处的峰宽定义在技术上与百分之十峰谷的定义是相当的。一个通用的标准是将分辨率定义为半峰高处的全峰宽，有时缩写为半高宽(FWHM)。最好在第一次使用这个缩写词的的时候定义它。
“分辨率”一词与“分辨能力”基本上是可以互换使用的。事实上，分辨率和分辨能力的定义都是R = (m / Dm)。而其差别在于如何界定Dm。
磁场质谱仪的分辨率通常由百分之十峰谷定义给出。其中Dm被定义为由百分之十峰谷分开的两个峰的质量差异。
所有其他关于分辨率的定义都是基于单一峰值的。 由于分辨率可以有多种方法定义，在比较数值之前要注意其定义。举例来说，在百分之十峰谷定义中D m是基于真正的峰的分离；而百分之五峰高处的峰宽定义中Dm则是基于一个单一的峰值测量，但就分辨率定义来说两者是相当的，下面也会谈到这点。
对于四极杆质谱，回旋共振，Orbitrap和飞行时间质谱仪来说，最常用的分辨率衡量方法遵循半高宽的定义，即使用百分之五十峰高处的峰宽来衡量Dm。
而使用半高宽的定义取得的数值自然总是大于使用“百分之五峰高处峰宽” (百分之十峰谷)定义取得的数值。事实上，按照百分之十峰谷的定义，要达到百分之十峰谷标准，半高宽定义下的分辨率的数值大约是百分之十峰谷定义下的分辨率数值的两倍左右。这意味着20000 的半高宽分辨率相当于10000的百分之十峰谷分辨率。
一台分辨率为10，000(FWHM)的仪器能够分离m/z为500.0和500.1的离子，然而不能分离质核比为1000.0和1000.1的离子。
(图一)
在 上面的例子中，分辨率数值是根据半高宽半高宽定义给出的，在右图中可以看到一氧化碳和氮气的基线分离。要达到这种分离标准，根据百分之十谷定义则只需要2300的分辨率。然而，在一个分辨率只有2300(半高宽)的仪器上 ，单个的一氧化碳和氮气峰(绿色和蓝色)则被合并起来给出粗黑线勾勒的信号。仪器的分辨率要至少达到5000 (半高宽)才能单独和准确测量每一个单峰的质量。
仪器类型和质量分辨率
在以下所有例子中， “分辨率”和“分辨能力”将作为同义词应用，而所有数值皆是基于半高宽的定义。
在四极杆离子阱(如赛默飞世尔科技的LTQ系列)和传输四极杆 (例如，赛默飞世尔科技的TSQ系列)仪器中 ，仪器的分辨率随质量线性增加，即如果仪器设置为进行整数分离(例如分离100和 101 ) ，那么在核质比为100时分辨率为200， 而当核质比为1000时，分辨率相应增加到2000 。这种分辨率设置就叫做“单位质量分辨率。 ”
飞行时间和双聚焦质谱仪(例如，TS DFS )的分辨能力是固定的。这意味着，整个质量范围的分辨率都是一样的。
赛默飞世尔的回旋共振和Orbitrap ™系列质谱仪运行中的分辨能力是不断变化的。在回旋共振的质谱仪中，分辨率随质量增加而线性递减，而对于Orbitrap质谱仪来说，分辨率则是随质量的平方根增加而线性递减的。例如：
Orbitrap质谱：在m / z 400时分辨率为 100000， 而在m / z 1600时分辨率则变为50000
回旋共振质谱：在m / z 400时分辨率为 100000， 而在m / z 1600时分辨率则变为25000
高分辨率的重要性：一个案例研究
高分辨质谱通常用来测量准确质量(从而使测定元素组成成为可能) ，或者进行非常专化的定量分析。在这两种情况下被测的都是一个峰的质量中心。在定量实验中，想要得到明确的结果，必须要有足够的分辨能力把目标分析物从任何可能 的干扰信号中分离出来。如果仪器的分辨率达不到要求，则会导致假阳性或假阴性的信号反应。
为了说明高分辨率质谱的应用和澄清这一分析在实践中是如何展开的，注入了116种农药混合物的马饲料提取液被用来作为一个基质极其复杂的样品进行分析。这项工作展示了分辨率高达100000全扫描方法的应用。实验揭示了高分辨率仪器在分辨共同洗脱的等分子量目标化合物，并确定其元素组成方面的优势。
一个从2到250 ppb(每一种化合物)的稀释系列被分别在两个不同的分辨率设置下进行测量。此外，一个 100 ppb的相同混合物样品在50000分辨率下进行分析以确定这种方法最多可同时检测的物质数目。
方法
一套非混合单级Orbitrap质谱仪( Exactive™ ，赛默飞世尔， 不来梅 ，德国) ，和超高效液相色谱仪(赛默飞世尔Accela ，赛默飞世尔，圣何塞，美国)联用的仪器被用来分析一个极为复杂的混合了116种不同浓度的杀虫剂，霉菌毒素及植物毒素的样品。 流动相为水/乙腈混合液，固定相为于50 × 2毫米反相碳十八柱(赛默飞世尔Hypersil GOLD 1.9微米颗粒，赛默飞世尔，麦迪逊，美国)，进行12分钟梯度洗脱。
该 方法的灵敏度，选择性和线性度用标准溶液和动物饲料提取液进行了评估。质谱测量分别在不同的分辨率设置(R= 15000和R = 50000 )下进行 ，因而可以对用飞行时间质谱仪获得的数据进行比较，并证明超高灵敏度的优势。 Orbitrap检测则使用自动化控制来控制进入检测器的离子数量(自动增益控制，指标值= 106 ) 。
结果
等分子量杀虫剂的分离
在等分子量化合物共同洗脱的情况下，如果质谱的分辨率不足以分离这些化合物， 则会导致质量准确度和元素组成产生偏差。图2显示了两种杀虫剂噻虫嗪( C8H10ClN5O3S )和对硫磷( C10H14NO5PS ) ，两者的质子化分子离子质量分别为292.02656和292.04031。高于40000的分辨率对于彻底分离这两种化合物的质子化分子离子是必须的。这对于在有高浓度组分存在的情况下分析低浓度化合物是一个先决条件。图2中的示例显示了对大约比例为1:3的两种农药的检测的和拟合的。
(图二)
元素组成检测方面的影响
有限的15000分辨率导致两个主要的局限性。首先，检测未分离的双峰可能导致超出Exactive仪器特征精确度规范的重大质量误差。因此，在较低的分辨率设置下测定元素组成的质量窗口必须增大，造成对未知或目标化合物可能的元素组成建议数目过多。
这一点可以从图三的例子中看到， 图三为抗蚜威在m / z 239.1503。由于存在一个等分子量干扰物，239处的峰显示出质量误差为百万分之6.5 。在15000的分辨率下 ，干扰物的存在造成质量明显偏高，而在更高的分辨率(此处80000 )下 ，双峰被很清楚的分离开来，而质量精确度绝对在仪器规范之内。
(图三)
为了将可能的元素组成结果的数量限制在一个单一的可靠结果上，我们使用了一个先进的算法软件。它考虑到单一同位素峰的峰高和质量精度及其同位素峰。然而，为了 正常运行，所有同位素峰的准确质量值都必须在规定的限度内。只有使用高分辨率才能确保没有干扰峰(图4 中可以看出) 。在这里，杀菌剂嘧菌酯显示在分辨率15000和80000 。中等分辨率图谱显示出很好的单一同位素峰的质量准确度，但A +1和A +2离子质量误差却高得异乎寻常。
这 是由于一个m / z 405.1452的干扰物在中等分辨率不能得到分离而造成的。而高分辨率谱图对所有三个测量的同位素都显示出极好的质量精度。利用在〜 15000分辨率下取得的数据来确定元素成分将导致误导性或不正确的数据。只有足够的高分辨率才能准确测得完整的分子离子簇质量，从而使自动分析出一个高可信度的元素分子式成为可能。
(图四)
LC - MS法对添加农药的饲料提取样品分析显示出116个化合物中的95个在基质中浓度达到100ppb。图五显示出重叠的所有116个离子谱图( 3ppm窗口) 浓度在基质中均为50ppb 。在不同浓度下检测到的农药数量如图五所示 。这些数据表明，分辨率设置越高，在3ppm提取窗口内检测到的化合物数目就越多(灵敏度更高)。图6体现了这一点 ，其中显示了在15000和50000分辨率下提取的浓度为50ppb 的Sulcotrion离子谱图。分辨率更高的谱中显示出两个峰，其中较小的一个才 是Sulcotrion 。
杀虫剂信号在较低分辨率的峰下被完全覆盖了。Sulcotrion存在的唯一标志是一个稍宽的峰或者说峰肩和干扰离子的质量向高偏移。如果只在分辨率15000进行分析。这将导致假阴性结果。这也是造成在15000分辨率下所检测到的组分数目相对于更高分辨率下检测到的组分数目减少的不成比例的主要原因(图6 )
(图五，图六)
出于这一原因，一个稀释系列在更高的分辨率设置下进行测定： 2 ppb， 10 ppb， 50 ppb ，和250 ppg。结果表明线性度非常的好并直至2 ppb，检定出从本质上几乎无法区分的峰。
结论
高分辨率LC-MSn分析(使用Orbitrap技术能取得高达100000的分辨率)为复杂样品分析提供准确的质量精度，并为复杂基质样品的多残 留筛选分析提供出色的灵敏度，线性度和选择性，正如以上级别的高分辨率仪器所证明。飞行时间质谱仪固有的低分辨率大大增加了由未分离的背景基质造成质量测量不准确的重大风险。一 个在环境监管中的关键问题是假阴性结果可能造成严重的健康后果。
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