【讨 论】为什么大家还在使用2D

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• 3648755 (2014-3-05 14:25:43)

  
  2D也好dige也好，LC-MS也好都已经是比较常用的技术了，在不同的实验经费和平台下选择合适的使用，谈不上先进但也谈不上落后。
  MCP上还是有2D的，能不能发好的文章不在于你是不是使用2D还是什么，只要你的结果还可以，又能做点机理，发不了MCP，发proteomics或者JPR还是有可能的。
  但有一点，像以前那样找点差异点就能发JPR的时代已经过去了，必需要做机理了。

• windboy (2014-3-05 14:26:06)

  目前研究的重点是相对定量，撇开2D的样品兼容性不谈，利用染色获取的颜色浓度差异在多大程度上可以重复可以确定是一个问题，同样的样品，你跑2块胶，颜色可能都不一样，更何况不同的样品，不同的操作。所以2D给我个人的感觉不很可靠的，除非有很好的重复性。
  2D的另一个弊端就是低效率，一张胶切100个点已经是不小的工作量了，同样的样品如果用shotgun的技术路线，我相信鉴定出来的蛋白远大于maldi，并且如果你这个蛋白点在考马斯染色下就可以看到的话，我相信在shotgun里面一定可以发现。shotgun也相对节省时间花销。现在我个人比较偏爱SDS-gel之后的shotgun技术路线。2D我感觉在你有很明确的目标蛋白的时候可以考虑，其他情况下好像基本没有优势。
  一定要做机理这点我很赞同，发现差异就发文章的年代已经一去不复返了，所以基本不要去看早期发表的蛋白质组学的文章，除非是技术方面的，欢迎大家讨论

• wmp1234 (2014-3-05 14:26:26)

  我是2D和LC-MS同时进行.发现一些差异蛋白,这些蛋白存在一定的交集.
  总之,两者方法各有优缺点,但今后的主流会是shotgun路线了.

• 我佛慈悲 (2014-3-05 14:26:55)

  请教：
  如何用鸟枪法进行蛋白组学研究？

• windboy (2014-3-05 14:27:33)

  QUOTE:

  原帖由 wmp1234 于 2014-3-5 14:26 发表
  我是2D和LC-MS同时进行.发现一些差异蛋白,这些蛋白存在一定的交集.
  总之,两者方法各有优缺点,但今后的主流会是shotgun路线了.

  请问您shotgun时用的什么技术来定量，如果走标记路线的话，在2D里面检测到的真阳性差异基本都应该可以在shotgun里面检测出来的，如果非标的话，就不那么可靠了。所以shotgun标记路线现在才是目前定量蛋白质组的王道。

• windboy (2014-3-05 14:28:01)

  QUOTE:

  原帖由 我佛慈悲 于 2014-3-5 14:26 发表
  请教：
  如何用鸟枪法进行蛋白组学研究？

  说白了就是以下几个层面，
  蛋白分离
  酶解
  肽段分离
  LC-MSMS
  具体的实验设计可能会省略上面的蛋白分离或肽段分离，如果蛋白分了很多组分，一般来说，肽段混合物可以直接进lcms，也有人喜欢把省略蛋白分离（有时是技术手段的局限，比如用o18水标记的话，只能在肽段分离层面下功夫），把蛋白全切了，再分肽段为多组分，之后进lcmsms

• linlinstar (2014-3-05 14:29:04)

  楼上几位大侠说的“机理”我不大明白，可以举个例子吗

• linlinstar (2014-3-05 14:29:34)

  QUOTE:

  原帖由 windboy 于 2014-3-5 14:26 发表
  目前研究的重点是相对定量，撇开2D的样品兼容性不谈，利用染色获取的颜色浓度差异在多大程度上可以重复可以确定是一个问题，同样的样品，你跑2块胶，颜色可能都不一样，更何况不同的样品，不同的操作。所以2D给我个人的感觉不很可 ...

  本人在蛋白质组学方面还是菜鸟，哪位大侠能否简要介绍一下“shotgun”

• greenbee (2014-3-05 14:29:58)

  QUOTE:

  原帖由 3648755 于 2014-3-5 14:25 发表
  
  2D也好dige也好，LC-MS也好都已经是比较常用的技术了，在不同的实验经费和平台下选择合适的使用，谈不上先进但也谈不上落后。
  MCP上还是有2D的，能不能发好的文章不在于你是不是使用2D还是什么，只要你的结果还可以，又能做点机 ...

  不管是2D，还是dige，或者LC-MS，能解决问题，发表文章，就是好技术。

• moonlight45 (2014-3-05 14:30:47)

  
  有时间谁介绍一下shotgun吧，这个肯定是主流，它做蛋白相互作用还是很可靠啊，标记的现在应该不是技术难题了，只要重复性解决了，就比较好，只是比较贵啊！

• 莲花白 (2014-3-05 14:31:06)

  
  虽然大家都认为将来是shotgun技术会占主导,但是大家也可以分析一下shotgun的缺陷.我做了点shotgun的工作,私下认为也是存在很多问题的.

• eve_49 (2014-3-05 14:31:26)

  
  嗯 同上
  不是很懂SHOTGUN？
  还有“机理”是指哪方面
  新手来的 ~~
  渴望了解这方面的知识！！！

• duoduo (2014-3-05 14:32:44)

  顶上去，也想知道楼主说的“机理”到底指的什么，是差异点的作用机制吗？
  我个人觉得蛋白质组学找到差异点以后就到了一个瓶颈，哪怕把找到的差异点用免疫印记，PCR等方法去验证，其意义也是有限的，很想跟大家探讨，蛋白质组学后面的走向应该是如何的

• ritou1985 (2014-3-05 14:33:15)

  关注中，还请大虾们指教。2D的重复性怎么提高，2D后续到底都可以怎么延续下去才更有意义。最近确实茫然了... ...

• windboy (2014-3-05 14:37:34)

  呵呵，就我的理解，现在单纯的说鉴定了什么蛋白，哪个蛋白是差异的蛋白用处不大，好的杂志根本不会接收这样的文章了，关键要首先确定这个差异是真实的，蛋白鉴定是可靠，然后要试图找出这个差异产生的原因。
  作蛋白质组的大部分人有两种背景，一个是化学的，一个是生物的，做化学的在仪器方面比较专长，但是得到数据之后怎么分析这些数据是一个困难。对于生物背景的人来说，繁琐的仪器设置和操作可能会令他们头疼，所以最好的办法就是要互相结合，互相了解。当你发现了一个差异蛋白，首先要做的就是去查文献，看有没有关于这个蛋白和你研究的疾病相关的报道，或者和这个蛋白相互作用的蛋白与你的疾病相关，试图去解释这个通路，这个过程可以用到各种技术手段，当然主要是western还有分子生物学相关技术，基本就是一环扣一环，都弄明白了，就是个很漂亮的工作，呵呵
  

• 831226 (2014-3-05 14:38:04)

  如何去做机理方面的东西呢？比如细胞，研究什么机理？

• jrwyyplt (2014-3-05 14:38:56)

  
  机理是一个很大的范畴，很难具体说做什么东西。但有一点是明确的，找到一批差异点并验证其中的几个已经发不了上档次的文章。
  关于差异点以后的机理，下面是我个人比较狭隘的理解，希望不会误导各位朋友。
  找到差异点后，可以用一些跑pathway的软件看看有哪些信号途径涉及其中。并从中寻找一条和你研究兴趣有关的信号途径，比如磷酸化途径、凋亡途径、wnt通路等。当然，选择什么途径要充分考虑你的研究目的、你所使用的药物或毒物特点、细胞特点和你筛选得到的蛋白点等。
  围绕你选定的 途径，对筛选得到的相关蛋白的表达、修饰、激活与否进行研究，当然也可以增加一些该通路重要蛋白但你未筛选到的。
  能够用一条相对较为完整的途径对你的筛选结果进行解释，这样的结果是非常理想的，也比较容易发高分。
  上面的观点可能不是十分正确，也希望做蛋白质组的朋友们进行讨论。
  但再次强调，企图找点差异蛋白就发文章的日子已经过去了。这个很好理解，今天你就跑个PCR能发文章吗？蛋白质组技术归根结底是一个普通的技术，和PCR是一路的。

• youyou99 (2014-3-05 14:39:14)

  
  赞同大家的观点。
  方法本身是不分好坏的，关键是看我们如何利用了。

• cwcwcww (2014-3-05 14:39:34)

  楼上说得很对，同pcr一样，2d只是实现我们目的的工具，
  如果以高标准要求的话，单靠找到差异点已经发不出什么好文章了．
  而且很重要的一点，即便你有感兴趣的通路，
  往下做不一定能够得出您所预期的结果，这个时候怎样解释原有的数据？
  我觉得路还很长，技术是成熟的，道路是曲折的．一起加油吧．呵呵

• windboy (2014-3-05 14:40:01)

  
  是啊,差异蛋白找出来以后做机理，说说简单但可能要3年5年甚至10年才能完成一条通路，也可能没有做了几年什么都没有啊。