质谱+MassWorks 给您更好的有机物定性结果

2011-11-14 14:56 来源: 分析测试百科
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  2011年11月10日,MassWorks发明人王永东博士做客分析测试百科网,向广大网友做了题为《质谱+MassWorks给您更好的有机物定性结果》的报告,共同探讨MassWorks如何让您的质谱获得更好、更准的化合物鉴定结果。MassWorks在2006年投放市场,即获年度匹兹堡Pittcon最富创新产品的铜制奖章。它改变了人们使用质谱的传统观念,拓展了世界上多种类型质谱的潜能。MassWorks在四极杆质谱上可提高100倍以上的质量准确度;并在获得准确质量的各种质谱(四极杆/飞行时间/FT ICR/Orbitrap)上,利用先进的谱图准确度匹配技术,获得化合物鉴定近乎完美的结果。

  谱图校正理论

  关于有机化合物确认,美国《有机化学杂志》要求最为严格,在2011年1月份之前规定:若要在该杂志发表文章,必须使用高分辨质谱确认,而且质量精度要达到5ppm,许多质谱工作者都认为此条文不合理。在1月份之后,该条文做了修改,不再要求是高分辨质谱,而且质量精度变为3mDa。3mDa质量精度在小分子(<100Da)具有很强的杀伤力,但是在大分子(e.g.,400Da)并不充分。对于分子量是91,若能把质量测到3mDa,就只有一个分子式;如果分子量是400,就有317个可能性,此时分子确认的可靠性就差了很多。

有机化合物分子式确认

  对于上面的问题,许多厂商都提出使用高分辨质谱,虽然质量误差可以达到100ppb,但依然有7个分子式,而且质量到小数点第四位都还是相同的,即便可以根据电荷数去掉两个,依然很难确定剩下的5个分子式中哪个是对的。王博士模拟了这5个分子式的理论质谱图,对400的那个峰进行放大,可以发现它们依次是由15N、33S、13C和2H形成的,这是在高分辨质谱上。在低分辨质谱上,由于质量精度不够,信息被加和在一起了,但信息是客观存在的,只要谱图是准确的,即可以对其进行校正。通过理论质谱图和实际质谱图进行比较,利用校正曲线去校正实际质谱图,得到的谱图就比较完美了。从而可以轻松确定质心、位置、高度、宽度和面积,即获得了精确质量,误差在±0.002~0.005Da,质量精度提高了100倍。为了获得唯一的分子式,就需要使用谱图准确度,对可能的分子式模拟出理论质谱图,与校正后的质谱图进行比较,如果匹配的完美无缺,即可认为这个就是可能的分子式。

低分辨质谱上具有丰富的峰形信息

独特的质谱校正方法

  MassWorks与AutoID及其应用

  根据谱图准确度理论,王博士推出了两款产品:一是MassWorks研究软件,可以应用在四极杆GC/MS和LC/MS的分子识别,及TOF、Orbitrap、FT ICR MS等高分辨质谱;另一是AutoID 全自动解决方案,用于实时、在线分析LC/MS,可以高通量、批处理样品。

  MassWorks可运用于所有的GC/MS系统,易选择、易操作,离子碎片分布在45-550Da范围内,而且可用于内标法。对未知物分析时,通过峰形校正去除了一起自生的线性峰形,同时将质量精确度提高了100倍以上。对可能的80-100个分子式,怎样判断哪一个是正确的分子式?一个方法是根据质量误差进行排序,却得出了一个错位的结果,而根据谱图准确度实现了分子式的准确识别,并得出了正确结果。对于高分辨质谱,MassWorks也能帮上忙,对单同位素峰提供完美的峰形校正。

GC/MS分子式识别

  大分子药对人体副作用比较小,因此越来越受到人们的关注,可却存在一个降解的问题。如胞核嘧啶水解脱胺产生尿嘧啶,5-甲基胞核嘧啶水解脱胺产生胸肝。在37℃ Cand pH 7.4条件下,ssDNA中胞核嘧啶和5-甲基胞核嘧啶片段的脱氨基速率分别为2×10-10s-1和1×10-9s-1;或者在pH 7.4和37℃条件一年后,一条含4个5-甲基胞核嘧啶的序列片段中含有11%只有一个位点被脱氨基的分子,pH值越高脱胺速度越快。低聚核苷酸有10%甚至2%降解,如何检测其中少量的脱氨基成分?用一般的分析方法,谱图基本一样,而用MassWorks软件可以分析它的降解率,甚至是低于2%的降解率也可以检测。

MassWorks软件可用于检测低于2%的脱氨基成分

  AutoID是全自动软件,非常适合大批量合成有机物的验证,AutoID开放式校正流程如下图。对于给定的目标化合物,质量误差6mDa,谱图准确度高达99%,质谱峰形覆盖良好;对未发现的目标化合物也可以检测,AutoID自动识别排在前三位的未知分子式,比较分子式的理论质谱图与校正质谱图,从而确定可能正确的分子式。

AutoID开放式校正流程

  最后,王博士总结说,对于有机物确认,质量精度很重要,谱图准确度更加重要,线性峰形校正是区分相似候选分子式的关键。开放的全自动分子式识别技术可实时应用于单四极杆质谱,而且可应用于高分辨MS,通过谱图准确度实现错误分子式的排除和定量分析。


  Q&A

  网友:有没有使用MassWorks软件分析氮同位素的例子?

  王永东博士:还没有。目前分析过12C、13C和14C,其中14C非天然,是放射性元素;氢分析过氘和氕。分析氮同位素,原理是一样的,应该可以。

  网友:质量校正的方法是否能够解决单四极杆假阳性的问题?

  王永东博士:谱图准确度可以去除掉很多假阳性。正如报告中所讲到的,用质量精确度得出很多种可能的分子式,最后选出甚至是错误的结果,而用谱图准确度能够更好地选择,减少假阳性。

  网友:请介绍一下Bruker的MW to formular软件与massworks性能比较的情况?

  王永东博士:MW to formular软件也在试图介绍同位素理论值与实验值的差别,作为筛选同位素的途径。两者之间最大的区别是,molweight to formular软件不对峰形进行校正,它假设实验数据符合某种分布,这种假设本身就存在百分之几的误差,这对于分析相近的分子式来说是很大的误差,所以其对分析帮不上太多的忙。

  网友:MassWorks软件在残留分析中(1ppb)的作用?

  王永东博士:分析农残有的是未知的,有的是在分析列表中有的进行定性和定量,可以利用MassWorks的质量精确度和谱图准确度来做离子提取图。输入一个表列,包含可能含有的残留的分子式,然后就去搜寻某种残留是否存在,根据质量精确度和同位素分布进行计算,所以对农残分析也是很有用的。

  网友:MassWorks软件可以在ICP-MS上使用吗?

  王永东博士:现在还不行。MassWorks软件是设计给有机质谱用的,很快就会有应用于无机质谱的,是对MassWorks软件性能的增加。

  网友:在背景很杂很高的情况下,MassWorks的优越性还能很好发挥吗?

  王永东博士:如果背景很高,就是有干扰,而且干扰不能很好地分离,甚至出峰时间和质量都接近,在这种情况下,对MassWorks就会有影响了,就会提示谱图准确度差了很多,此时可以用高分辨质谱进行分析。

  网友:NIST谱库中匹配率低,能否用MassWorks软件?

  王永东博士:这是MassWorks软件的优势之一。若在nist谱库中匹配率很低的话,就用MassWorks去看分子离子峰或者是碎片峰,筛选出正确的分子式。造成nist谱库匹配率低的原因可能有,多种化合物在同一时间出峰,还有就是信噪比低。

  网友:食品中非法添加物能否用质谱分析一次性全部测定?

  王永东博士:这是可能的。它跟AutoID比较相近,有机合成工作者知道是什么东西,不外乎是产物与反应物,通过一次测定可以把它们全部确定下来。食品中非法添加物假如有200种,它们的分子式是知道的,通过LCMS筛选,再用质量精确度和谱图准确度来确定。

  网友:做药物代谢的时候,对于未知代谢物的推断,谱库里没有的物质是不是推断不出来?

  王永东博士:现在大部分是不需要库的,库里存在的可以把它找到,不存在的也可根据谱图把它推断出来,推出来之后就把它保存在库里,备以后筛选用。特别是对于代谢组学里的应用,分析未知的代谢物是很常见的。

  网友:用AutoID的那些合成实验室,一般用的是什么质谱?是单四极杆吗?

  王永东博士:一般用的是单四极杆LCMS、GCMS,因为它比较稳定,而且操作简单,不容易出问题,即便出了问题也比较容易修。

  网友:请介绍一下Mass Works软件在推断未知代谢物中的应用?

  王永东博士:首先确定与药物是有关的,需用14C去标记,然后跟踪它的变化。对有14C的代谢物进行分子式和结构进行确定,即可推断未知代谢物。这在制药和香精、香料方面有这样的用户。

  网友:MassWorks 推算出来的物质是否有可能是不存在的,而只是为了实现分子量的匹配做的推算?

  王永东博士:这是有可能的。因为我们不用库,所以推算出来的分子式有可能是不存在的,当然对分子式的推算有诸多的限制,尽可能找到可能的、合理的分子式。另外,有些分子是以前没有合成的,经过推算还可以把它合成出来。如果限制太多,就有可能错过一些新的、以前没有的化合物。MassWorks软件的限制是可以设置的,取决于研究的目的。

  网友:你在报告中提到的校正谱图和标准谱图比对来求谱图准确度,那么标准谱图是理论推导的,还是实际用标样测得的呢?

  王永东博士:校正谱图是实际测样得到的谱图进行校正,标准谱图是根据分子式结构进行推算的,然后再求谱图准确度。

  网友:正确应用MassWorks软件,对采集MS谱图有怎样的质量要求?

  王永东博士:获得的数据要能够作图,而且采点要8个以上,测量时要有一个标样,校正时信噪比越高越好。

  网友:对于理论质谱图,是将条件默认为70eV吗?

  王永东博士:计算理论质谱图,只需要分子式和峰形函数。分子式是已知的,峰形函数就用校正以后谱图的峰形函数。理论质谱图对应一个分子式和一个峰形函数,不需要任何假设。所提到的70eV是与离子源的电压有关系的,50eV和70eV在实验中是不一样的,可以用MassWorks软件校正,转化到同一个能量下进行比较。

  网友:进行环境样品中未知物的分析时,目标物的浓度都很低,有时在质谱上打不出来,MassWorks软件能否发挥作用?

  王永东博士:要对未知物进行富集,或者质量扫描范围缩短,从而提高信噪比。

  网友:能否介绍一下MassWorks在NCI和PCI源方面的应用情况?

  王永东博士:即便同一台质谱仪,若离子源不同,则质量精确度和离子阱也会不同。所以,需要在相同离子源的同一台质谱条件上,使用MassWorks软件来鉴定未知物。另外,在正、负条件下进行校正时,都分别需要标样。