关于ccfDNA的提取,你想知道的都在这里

2016-12-01 00:00 来源: 生物通
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自2015年以来,液体活检就在医疗诊断领域掀起了一阵新风暴。这是一种非侵入性的方法,有望替代目前的侵入性方法,在早期实现疾病的诊断和监控。如今,液体活检已经应用在无创产前诊断(NIPT)、癌症的诊断和治疗等多个方面。在这些检测中,两大主角分别是循环游离DNA(ccfDNA)和循环肿瘤细胞(CTC)。

对于循环游离DNA的研究,QIAGEN近日推出了专用的采血管 C PAXgene Blood ccfDNA Tube,用于血液样本的采集和稳定。它的材质是特殊处理的高硬度透明塑料,可对抗运输过程中的撞击。采血管采用了一种非交联反应的稳定剂,可有效防止溶血及gDNA的释放,最大限度减少ccfDNA的改变。

关于ccfDNA的采集以及采血管的使用,QIAGEN的专家整理了人们最感兴趣的9个问题,在这里将答案与大家分享。

Q:采血量的最低要求是多少?
A: 对于市场上的大多数试剂盒,每次需要抽取8-10 ml血液,才能进一步处理血浆和ccfDNA。PAXgene Blood ccfDNA Tube也类似,每次需要抽血10 ml。这种做法是为了确保真空管被装满时,每毫升血液中细胞稳定添加剂的量是0.15 ml。

Q:你所谈到的血液采集指的是全血、血清还是血浆?
A:对于样本采集,PAXgene Blood ccfDNA Tube采集的是人类全血。随后你可以通过产品附带的操作说明来处理血浆。ccfDNA可以利用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit手动纯化,也能利用PAXgene Blood ccfDNA Kit自动纯化。

Q:利用这种技术来获取母亲的血液样本,是否可以确定胎儿的性别?
A:我们已经做了这样的测试,不过需要注意的是,PAXgene Blood ccfDNA system是仅供科研使用的。一名用户使用了PAXgene Blood ccfDNA Tube以及QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit和QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit。他们采集了母亲血液,并分析了43个样品中的胎儿组分。之后利用Lifecodexx的PrenaTest成功确定胎儿的性别。分析结果表明,PAXgene Blood ccfDNA方法的结果与现有方法一致。

Q:DNA提取和PCR分析应采用什么样的血液稳定操作?
A:如果你能防止交联剂对DNA的修饰,那是再好不过了。PAXgene Blood ccfDNA Tube采用一种替代的解决方案,不涉及到交联。这种方案可以减少gDNA的释放,并有效防止溶血,在保留样品完整性的同时,防止对DNA的修饰。

Q:ccfDNA的分离操作是手动的还是自动的?
A:两者皆可!选择哪个试剂盒,取决于你希望在工作台上手动分离,还是交给仪器去完成,因为每种方法采用不同的试剂来提取ccfDNA。QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit是一种手动方法,它利用硅胶膜离心柱从血浆样本中提取ccfDNA。这个手动过程包括4个步骤:裂解、结合、洗涤和洗脱,可灵活选择1-5 ml的血浆上样量。对于自动化分离,可以选择QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA Kit。这个试剂盒可选择加入2.4 ml或4.8 ml的血浆。自动化操作采用磁珠技术让ccfDNA结合在磁珠的表面,确保快速分离得到高纯度的ccfDNA样品。

Q:如何定量分离出的ccfDNA?
A:鉴于ccfDNA的性质,这种游离DNA可能难以定量。对于健康个体,它的产量大约在每4 ml血浆中1-100 ng这个范围。若是研究对象处于各种疾病状态,则ccfDNA的浓度甚至远远超出这个范围。对定量而言,我们建议使用定量PCR或数字PCR。

Q:蝴蝶针采血适用于PAXgene Blood ccfDNA tube吗?
A:是的,PAXgene Blood ccfDNA tube适用于标准的血液采集设备。你也可以参考PAXgene Blood ccfDNA tube的操作手册,了解样本采集的更多内容。

Q:血液中的DNA甲基化状态是否保留?
A:是的,通过PAXgene Blood ccfDNA System纯化得到的ccfDNA可以与甲基化检测兼容,比如那些需要用亚硫酸氢盐处理的检测。之前,QIAGEN的科学家利用Agilent Bioanalyzer,在2个时间点(0天和6天)比较了EDTA、Streck和PAXgene Blood ccfDNA Tube的性能。他们发现,Streck样品的主要ccfDNA峰在6天后位移了7-8 bp,这表明试剂对DNA的修饰。

Q:哪些下游应用可分析ccfDNA?
A:目前有多种技术可分析ccfDNA,包括新一代测序、PCR、qPCR、数字PCR和SNP基因分型。到目前为止,利用PAXgene Blood ccfDNA System处理后获得的ccfDNA已经成功用于NGS和PCR,包括多重qPCR和ddPCR。