新型冠状病毒(2019-nCoV)双荧光qRT-PCR试剂盒使用说明
1.需要用户自己准备的耗材、仪器和试剂
a.具有FAM和VIC荧光通道的荧光定量PCR仪。
b.DNase-free、RNase-free的吸头、离心管、荧光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
c.生物安全柜。
d.RNA提取试剂盒。
2.样本准备
a.本试剂盒适用样本类型：上呼吸道标本(包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液)；下呼吸道标本(包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本)；组织培养物等样本。
b.样本采集具体方法请参考“2019新型冠状病毒核酸检测专家共识”和“新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南”。
c.样本采集后，可保存在病毒样品常规保存液进行病毒的保存，并须当日完成检测。否则按下述方案保存：2~8℃保存，不超过24小时；-20℃保存，不超过3个月；-70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融。也可以使用病毒RNA稳定保存液进行保存，室温可以保存7天左右。
d.将样品按照病毒RNA提取试剂盒中相应的要求和步骤进行RNA提取，提取的RNA可直接用于检测。若提取后不立即检测，也可保存于-70℃备用，同时应尽量避免反复冻融。
e.经假病毒模拟验证，本试剂盒也适用于保存于常规病毒保存液中的咽拭子、唾液等样品的直接检测，无须进行RNA的抽提。但实际操作时，须根据病毒样本的来源、保存液类型进行一定的对比测试。对于保存在病毒RNA稳定保存液的样品，必须进行RNA抽提后才能使用本试剂盒进行检测。不同数量的新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的各种病毒保存液(TE、PBS及含FBS和抗生素的HBSS)、细胞培养液(DMEM、1640，不含FBS)、RNA病毒直接qRT-PCR保存液中，未经抽提直接使用本试剂盒进行qRT-PCR检测的效果见下表。此处的病毒量为每个PCR反应体系中病毒的IU数。从下表数据可以看出，TE、PBS及常用的细胞培养液中保存的假病毒可以直接用于本试剂盒检测，而 RNA病毒直接qRT-PCR保存液效果更佳。含有FBS的HBSS可能由于FBS的影响，Ct值会高出约2-3。
| 病毒保存液 | TE | PBS | HBSS + 2% FBS + 1% PS | |||||||||
| 病毒量(IU) | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 |
| Ct平均值 | 25.46 | 26.43 | 27.73 | 28.44 | 25.51 | 26.40 | 27.50 | 28.42 | 27.58 | 28.57 | 29.38 | 30.38 |
| 标准偏差 | 0.096 | 0.157 | 0.420 | 0.122 | 0.069 | 0.015 | 0.081 | 0.259 | 0.156 | 0.054 | 0.040 | 0.174 |
| 病毒保存液 | DMEM | 1640 | BeyoDirect™ RNA病毒直接qRT-PCR保存液 | |||||||||
| 病毒量(IU) | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 | 400 | 200 | 100 | 50 |
| Ct平均值 | 24.99 | 25.86 | 26.76 | 28.37 | 25.38 | 25.98 | 27.19 | 28.00 | 24.23 | 25.25 | 26.73 | 27.75 |
| 标准偏差 | 0.035 | 0.187 | 0.562 | 0.090 | 0.100 | 0.277 | 0.203 | 0.084 | 0.118 | 0.180 | 0.129 | 0.232 |
f.核酸检测的各个步骤需要在指定区域进行，以避免交叉污染。例如样本处理、加样在样本处理区，扩增试剂准备在PCR前准备区，核酸扩增在检测区。
3.qRT-PCR反应体系的设置
a.融解并混匀反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
参考下表在室温或冰浴上设置qRT-PCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为25µl为例)。下表中的Template
RNA为样品RNA、试剂盒中提供的Negative Control或Positive
Control。建议每次检测都设置阴性对照(Negative control)和阳性对照(Positive control)。
| Reagent | Volume |
| Reaction Buffer | 17.5μl |
| Enzyme Mix | 2.5μl |
| Template RNA* | 5μl |
| Total Volume | 25μl |
*注：实际操作时，如果经验证测试可免RNA抽提而直接检测，则用RNA病毒样本直接替代Template RNA。
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
e.荧光检测通道的选择：ORF1ab基因荧光基团是VIC，可选择检测通道(Reporter)为VIC/HEX/JOE，淬灭基团(Quencher)是BHQ1，如果没有BHQ1，则选择无；N基因荧光基团是FAM，可选择检测通道为FAM，淬灭基团是TAMRA，如果没有TAMRA，则选择无。请将仪器的荧光内参设置为“None”，例如：对于ABI系列仪器，将“Passive
Reference”设置为“None”。
4.qRT-PCR反应程序
本试剂盒建议采用如下的qRT-PCR程序，本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex荧光定量PCR仪为例：
a.反转录：50℃ 20min
b.预变性：95℃ 2min
c.变性：95℃ 15sec
d.退火/延伸：60℃ 20sec
e.重复步骤c和步骤d，总共45个循环
f.最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果。
5.结果的定性判断
a.阳性对照：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤33。
b.阴性对照：无典型S型扩增曲线或Ct值>38。
c.阳性：如果待测样本检测结果VIC通道和FAM通道均Ct值≤35，则可判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阳性。
d.阴性：如果两个通道检测Ct值无数值或Ct值>38，且阳性对照品检测结果为阳性，此次结果判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阴性，但不排除其它冠状病毒感染的可能。
e.可疑：如果待测样本35<Ct值≤38，则此样本应重新提取核酸后再次进行检测。如重复检测结果显示两个通道Ct值均≤35，则判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阳性；如两个通道检测Ct值无数值或Ct值>38，则判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阴性；如其中任一通道35<Ct值≤38，则该样本为可疑样本，应通过其它方法如测序进行进一步的分析和检测。
