T/SBZYC 01-2021
地理标志产品 施秉太子参 组织培养与脱毒种苗扩繁技术规程
Geographical indication product Shibing Heterophylla heterophylla tissue culture and technical regulations for propagation of virus-free seedlings
- 标准号
- T/SBZYC 01-2021
- 发布
- 2021年
- 发布单位
- 中国团体标准
- 当前最新
- T/SBZYC 01-2021
- 适用范围
- 1 组织培养 1.1 组培室要求 符合GB19489和GB/T 22278规定。 1.2 培养基选择 以MS为基础培养基，所用药品符合GB437、GB/T628、GB/T647、GB/T659、GB/T664、GB/T666、GB/T671、GB/T1272、GB/T1274、GB/T1401、GB/T15899的规定。 1.3 培养基制备 母液配制和保存 将培养基配方扩大若干倍，一般为10倍~100倍的浓缩液体。药品配制严格按照GB/T603规定方法配制，用水应符合GB/T6682规定要求。称取药品的药匙必须专药专用。将配制好的母液分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数和日期，贮存在2℃~4℃的冰箱中，贮藏时间控制在90d内。储藏期间，如有霉菌和沉淀产生，需重新配置。 植物生长调节剂母液配制和保存 将各种植物生长调节剂单独配成浓度为50mg/100mL~100mg/100mL。多数植物生长调节剂难溶于水，其溶解方法：NAA、IBA、IAA等常用少量95%的乙醇溶解，然后加热溶解，再加蒸馏水定容。6-BA、KT等先用少量1mol/L盐酸溶解，再加蒸馏水定容。所用水要符合GB/T 6682的要求。 配制好植物生长调节剂分别贴上标签，标签写上名称、配制浓度和日期，贮存在2℃~4℃的冰箱中，贮藏时间控制在90d内。储藏期间，如有霉菌和沉淀产生，需重新配置。 培养基配制 培养基由MS基础培养基、蔗糖、琼脂、水组成，蔗糖和水分别符合GB 317和GB 5749规定。所需蔗糖浓度3g/L，琼脂粉浓度4g/L。培养基配制流程，见图1。 水 分 母 液 生长调节剂 蔗 糖 琼 脂 → 混 合 → 加热溶解 → 定 容 → 调节pH 分 ↓装 培养容器 → 洗 涤 → 干 燥 → 播 种 ← 凝 固 ← 冷 却 ← 高压灭菌 ← 封 口 图1太子参培养基的配制流程图 诱导培养基为:MS+6-BA0～1.0+NAA0～0.1，按照培养基配制程序配制。 继代增殖培养基为:MS+6-BA0.5～1.5+NAA0.01～0.1，按照培养基配制程序配制。 壮苗及生根培养基为:MS+6-BA0+NAA0，按照培养基配制程序配制。 pH值调节 太子参培养基最佳pH值控制在5.6~5.8，一般用pH计或pH试纸测试，常用（1mol/L） NaOH或HCl进行调整。 培养基分装和灭菌 将配制好的培养基趁热分装，分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。操作时，尽量避免将培养基粘到容器口和容器壁上，否则容易引起污染。将已分装好培养基封口并注明配制日期和培养基种类后即进行灭菌，灭菌锅内压力为0.105MPa、温度达121℃状态下保持15min～20 min进行灭菌。 1.4 环境灭菌 对环境进行定期灭菌。方法是用75%乙醇或0.1%新吉尔灭进行喷洒。对无菌操作室（接种室）、培养室和准备室采用紫外灯灭菌方法。接种所用的超净工作台在空气过滤灭菌的基础上再配合使用紫外灯照射灭菌20min~30 min，再用75%乙醇对超净工作台表面进行擦拭。 1.5 接种工具灭菌 接种用的工具、无菌水等必须在灭菌锅内压力为0.105MPa、温度达121℃状态下保持15~20 min进行灭菌。 1.6 外植体选择与处理 选择生长健壮、无病虫害的优良太子参植株为外植体材料。 将太子参的茎尖、茎段用5%~10%洗衣粉漂洗2min~3min，洗去茎尖、茎段上的蜡质层及泥土、粉尘，用自来水冲洗30min后拿到接种室，用75%酒精表面消毒20s，无菌水冲洗2次；再用0.1%Hg消毒3min~8min，无菌水冲洗8次~10次，以除去残留消毒液。 1.7 外植体诱导培养 将处理好的太子参外植体，在无菌条件下，用解剖刀和解剖针在显微镜下剥离0.5mm~1mm的茎尖，切取茎段（每段留一个节），分别接种于诱导培养基。茎尖、茎段应插入培养基，芽不能陷入培养基中。接种后做好标记。经7d~10d培养，芽开始萌动生长，30d后芽长到1cm~2cm，同时有少量丛芽分化。 1.8 继代增殖培养 将诱导出的不定芽转接于继代增殖培养基中，经30d培养，形成丛生芽，并有少量根系分化。 1.9 脱毒检验 获得的丛生芽须经有资质的检验单位检测，确认无毒后，进入壮苗及生根培养。 1.10 壮苗及生根培养 将丛生芽转接到壮苗及生根培养基中，经30d左右，形成完整的试管苗，并有根系的分化。 1.11 培养条件 培养温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000LX~3000LX。太子参组织培养技术流程见图2。 2 驯化 2.1 大棚与基质消毒 移栽前，用0.02%~0.04%高锰酸钾和0.1%~0.5%甲醛对大棚进行熏蒸消毒。用0.04%高锰酸钾溶液对基质消毒灭菌。 2.2 炼苗 试管苗移栽前，将生长健壮、根5条~6条，长0.cm5~1.0cm，带3叶~4叶的试管苗连同培养瓶放置移栽大棚2d~3d，然后打开瓶口再放置2d~3d，使试管苗逐渐适应外界环境。 2.3 脱毒苗移栽 将驯化后的脱毒苗用镊子小心取出，洗去根部培养基，用500倍多菌灵或甲基托布津浸泡30min，用自来水冲洗干净后，定植于已灭菌的基质（珍珠岩:腐殖土=1:2）中。移栽后用遮阳率75%~90%的遮阳网搭小拱棚遮阳，待苗生长5d~7d后拆除。 优良单株 ↓ 块根芽头或种子 ↓ 微茎尖 ↓ → 未脱毒苗淘汰 病毒检测 ↓ 脱毒苗 ↓ 增殖培养 → 生根培养 → 炼苗栽培 ↓ 商品种 ← 2-3代繁殖 ← 原原种 图2 太子参组织培养技术流程 2.4 脱毒苗管理及种参收获 脱毒苗移栽后要注意保湿，基质内含水量保持在50%~60%。移栽一周后，每周喷施1/2MS营养液1次~2次，定期用500倍多菌灵或甲基拖布津喷洒杀菌剂，预防病虫害发生，在整个生长期要及时除草。 脱毒苗生长180d~210d后，即可收获太子参原原种。 2.5 脱毒检验 获得的原原种须经有资质的检验单位，按照《植物病毒检测方法》检测，确认无毒后，进入加代扩繁。 3 扩繁 检验无毒的原原种按照T/SBZYC 02加代扩繁，经过2代~3代繁殖成为原种，原种经加代繁殖即成为生产用脱毒良种。