亲和色谱法 affinity chromatography

离子交换色谱法 ion exchange chromatography，IEC

离子色谱法 ion chromatography

离子抑制色谱法 ion suppression chromatography

离子对色谱法 ion pair chromatography

疏水作用色谱法 hydrophobic interaction chromatography

制备液相色谱法 preparative liquid chromatography

平面色谱法 planar chromatography

纸色谱法 paper chromatography

薄层色谱法 thin layer chromatography，TLC

高效薄层色谱法 high performance thin layer chromatography，HPTLC

浸渍薄层色谱法 impregnated thin layer chromatography

凝胶薄层色谱法 gel thin layer chromatography

离子交换薄层色谱法 ion exchange thin layer chromatography

制备薄层色谱法 preparative thin layer chromatography

薄层棒色谱法 thin layer rod chromatography

液相色谱仪 liquid chromatograph

制备液相色谱仪 preparative liquid chromatograph

凝胶渗透色谱仪 gel permeation chromatograph

涂布器 spreader

点样器 sample applicator

色谱柱 chromatographic column

棒状色谱柱 monolith column monolith column

微粒柱 microparticle column

填充毛细管柱 packed capillary column

空心柱 open tubular column

微径柱 microbore column

混合柱 mixed column

组合柱 coupled column

预柱 precolumn

保护柱 guard column

预饱和柱 presaturation column

浓缩柱 concentrating column

抑制柱 suppression column

薄层板 thin layer plate

浓缩区薄层板 concentrating thin layer plate

荧光薄层板 fluorescence thin layer plate

反相薄层板 reversed phase thin layer plate

梯度薄层板 gradient thin layer plate

烧结板 sintered plate

展开室 development chamber

往复泵 reciprocating pump

注射泵 syringe pump

气动泵 pneumatic pump

蠕动泵 peristaltic pump

检测器 detector

微分检测器 differential detector

积分检测器 integral detector

总体性能检测器 bulk property detector

溶质性能检测器 solute property detector

(示差)折光率检测器 [differential] refractive index detector

荧光检测器 fluorescence detector

紫外可见光检测器 ultraviolet visible detector

电化学检测器 electrochemical detector

蒸发(激光)光散射检测器 [laser] light scattering detector

光密度计 densitometer

薄层扫描仪 thin layer scanner

柱后反应器 post-column reactor

体积标记器 volume marker

记录器 recorder

积分仪 integrator

馏分收集器 fraction collector

工作站 work station

固定相 stationary phase

固定液 stationary liquid

载体 support

柱填充剂 column packing

化学键合相填充剂 chemically bonded phase packing

薄壳型填充剂 pellicular packing

多孔型填充剂 porous packing

吸附剂 adsorbent

离子交换剂 ion exchanger

基体 matrix

载板 support plate

粘合剂 binder

流动相 mobile phase

洗脱(淋洗)剂 eluant，eluent

展开剂 developer

等水容剂 isohydric solvent

改性剂 modifier

显色剂 color [developing] agent

死时间 t0，dead time

保留时间 tR，retention time

调整保留时间 t'R，adjusted retention time

死体积 V0，dead volume

保留体积 vR，retention volume

调整保留体积 v'R，adjusted retention volume

柱外体积 Vext，extra-column volune

粒间体积 V0，interstitial volume

(多孔填充剂的)孔体积 VP，pore volume of porous packing

液相总体积 Vtol，total liquid volume

洗脱体积 ve，elution volume

流体力学体积 vh，hydrodynamic volume

相对保留值 ri.s，relative retention value

分离因子 α，separation factor

流动相迁移距离 dm，mobile phase migration distance

流动相前沿 mobile phase front

溶质迁移距离 ds，solute migration distance

比移值 Rf，Rf value

高比移值 hRf，high Rf value

相对比移值 Ri.s，relative Rf value

保留常数值 Rm，Rm value

板效能 plate efficiency

折合板高 hr，reduced plate height

分离度 R，resolution

液相载荷量 liquid phase loading

离子交换容量 ion exchange capacity

负载容量 loading capacity

渗透极限 permeability limit

排除极限 Vh，max，exclusion limit

拖尾因子 T，tailing factor

柱外效应 extra-column effect

管壁效应 wall effect

间隔臂效应 spacer arm effect

边缘效应 edge effect

斑点定位法 localization of spot

放射自显影法 autoradiography

原位定量 in situ quantitation

生物自显影法 bioautography

归一法 normalization method

内标法 internal standard method

外标法 external standard method

叠加法 addition method

普适校准(曲线、函数) calibration function or curve [function]

谱带扩展(加宽) band broadening

(分离作用的)校准函数或校准曲线 universal calibration function or curve [of separation]

加宽校正 broadening correction

加宽校正因子 broadening correction factor

溶剂强度参数 ε0，solvent strength parameter

洗脱序列 eluotropic series

洗脱(淋洗) elution

等度洗脱 gradient elution

梯度洗脱 gradient elution

(再)循环洗脱 recycling elution

线性溶剂强度洗脱 linear solvent strength gradient

程序溶剂 programmed solvent

程序压力 programmed pressure

程序流速 programmed flow

展开 development

上行展开 ascending development

下行展开 descending development

双向展开 two dimensional development

环形展开 circular development

离心展开 centrifugal development

向心展开 centripetal development

径向展开 radial development

多次展开 multiple development

分步展开 stepwise development

连续展开 continuous development

梯度展开 gradient development

匀浆填充 slurry packing

停流进样 stop-flow injection

阀进样 valve injection

柱上富集 on-column enrichment

流出液 eluate

柱上检测 on-column detection

柱寿命 column life

柱流失 column bleeding

显谱 visualization

活化 activation

反冲 back flushing

脱气 degassing

沟流 channeling

过载 overloading

HPLC分析是系统的工作，每个环节都很重要；看似简单的环节，反而容易疏忽，引起整个实验的结果偏差，因此养成良好的习惯是很重要的。色谱柱是色谱系统的心脏，液相色谱柱的正确安装与使用，是色谱工作的关键；也是获得正确可靠的实验数据的必经之路。

一·液相色谱柱的安装

1.液相色谱柱的结构：

  a.空柱由柱接头柱管及滤片组装而成

   柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英才外螺纹，另一端是3/16英才的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英才外螺纹与1/4英寸柱管（￠6.35mm）连接，中间放置压环用于密封。3/16英才的内螺纹与1/16英才（￠1.57mm）的连接管连接，之间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用￠1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后在拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上（连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸。

    在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片（或滤网），用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

   b.柱填料：

    液相色谱柱的分离作用是在填料和流动相之间进行的，柱子的分类是根据填料类型而定。

    正相柱：多以硅胶为填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10um的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，—NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

     反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他反相填料还有键合C8，C4，C2，苯基等，其颗粒直径在3-10um之间。

 2.色谱柱的安装

   a.拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型，尺寸，出厂日期以及柱内储存的溶剂。

   b.拧下柱两端的密封堵头放回包装盒备用。

   c.按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口连接（如条件允许，建议在柱前使用保护柱）；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为.57mm、内径为0.1mm-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈，切记不要用力太大。如色谱柱通过流动相加压后有漏夜现象，请用扳手顺时针拧1/4圈，直至不漏夜为止。

二·液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行的柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只要这样测试的结果才有可比性。

1.样品的前处理：

a.最好使用流动相溶解样品。

b.使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c.使用0.45um的过滤膜除去微粒杂质。

 2.流动相的配置：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a.流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。

b.流动相具有一定的惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。

c.流动相的黏度要尽量的小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液压泵的使用寿命（可运行提高温度的方法降低流动相的黏度）。

d.流动相的化学性质要与使用的检测器相适应。如用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e.流动相的沸点不要太低，负责容易产生气泡，导致实验无法进行。

f.在流动相配置好后，一定进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

 3.流动相流速的选择：

   因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6 mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。

   当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

1）.由于甲醇的廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系（必须使用乙腈的除外）。

2）.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的乙烷做流动相，没有提纯的乙烷不的使用。用水最好使用超纯水（电阻率大于18兆欧），去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析的结果。

3）.含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌的生长。

4）.流动相要求使用0.45um滤膜过滤，除去微粒杂质。

5）.使用HPLC级溶剂配置流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

 4.柱性能的测试：

——启动液相色谱仪：

a. 流动相流速设定为1ml/min。

b．UV检测器波长设定为254nm。

——使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。

——记录并计算测试结果。

高效液相色谱仪操作步骤（原文摘录自网络）：

1）过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2）对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3）打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4） 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。 冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6）调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7）设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8）进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9）关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10）填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1）流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2）柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3）所有过柱子的液体均需严格的过滤。

 ）压力不能太大，最好不要超过2000 psi。

三、冲洗

       使HPLC系统良好运行的第三个要点是保持系统的清洁。你需要关注流动相流经该系统的所有地方，对于这些地方经常性的冲洗，将使你的系统保持在“Ready”状态。

1、流动相储液瓶

       首先要经常清洗流动相储液瓶，或者每做一批新样品更换一次流动相。一个脏的储液瓶将会污染注入的流动相。建议储液瓶中缓冲液使用时间不要超过一周，而有机溶剂使用时间不要超过一个月。也有人建议储液瓶中保持用溶剂充满，直到更换分析方法储液瓶需更换新溶剂（流动相组成发生变化）时，将旧溶剂倒掉更换新溶剂，这样胜于将溶剂用完。但这对于分析样品量少的实验室而言似乎有些浪费。仪器公司的工程师建议储水瓶的水要天天换，每周瓶子还应该用异丙醇清洗一次。有的实验室则在水里加入0.1～1 mM的甲酸抑制微生物的生长。这些做法看起来有些繁琐，但却能起到“磨刀不误砍柴工”作用。

 

2、泵

        接下来要冲洗的是泵。千万不要一分析完冲几分钟后就停泵，特别是当流动相中含有难挥发的缓冲液（如磷酸盐）时。如果仪器不是连续使用，当流动相蒸发时，难挥发物就会粘在活塞密封垫的表面，难挥发物将形成固形物沉淀。这是泵密封垫磨损和单向阀渗漏的主要原因之一。所以，无论使用长短，在停泵以前一定要用非缓冲液流动相冲洗泵在半个小时以上，要是流动相中有难挥发缓冲盐则建议冲洗的时间应该更长些。

 

3、自动进样器

        自动进样器也要按规定清洗。现在的仪器多配有自动进样器的冲洗液瓶，通常只要注意及时更换、补充冲洗液即可。自动进样器用的洗涤液也要采用与流动相相同的方式处理，并根据溶剂的有效期和规定，清洗储液瓶或更换洗涤液。现在的自动进样器设置、操作都很简单，如果时间允许（特别是利用夜间运行），每次分析完后设置进1、2针纯溶剂（如甲醇、乙腈），也是一个好做法。

 

4、色谱柱 

       对柱子的污染是随使用时间而增加。通常表现是：运行走基线时在记录的色谱图中基线噪音增加，泵压也增加。解决这个问题的最有效方法就是在每一批样品分析结束后或准备卸下柱子时用大量的流动相冲洗柱子（例如，甲醇、乙腈和水）。用梯度冲洗效果更好，具体的比例要根据柱子的说明书和性质而定。

 

5、检测器

        如果是正常使用，检测器将依据其性质并按照说明书规定进行洗。例如UV/VIS检测器或FL检测器，在对柱子和系统进行冲洗时也就一同对检测器流通池中污染物进行了清洗。但是蒸发光检测器或质谱仪则需要按照说明书进行定期清洗。这些检测器在使用时会有难挥发污染物沉积，如质谱仪离子源的喷针、毛细管、锥孔板、预四极等部件，因而需要定期清洗。而且对联有这些检测器的系统冲洗时，最好与这些检测器断开，以减少对检测器的污染。

 

        总之，实验室日常使用的液相色谱仪要是能认真做好这三项工作——脱气、过滤和冲洗，你的仪器可以得到良好的预防性维护，使用时就会感到比较顺手。当然，在实际操作时遇到的问题并没有这么简单，但这三个良好习惯将是正确操作、使用HPLC系统的基础。

二、过滤

         任何颗粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此，要采取各种预防措施，包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。在HPLC系统中，颗粒物的主要来源有三个途径：流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。

1、流动相

        如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2 µm微孔滤膜过滤。同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2 µm微孔滤膜。然而，如果有任何一种缓冲液中加入了固体物，例如磷酸盐，流动相过滤将是必要的一个步骤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边缘挤压就会产生塑料颗粒。在这种情况下，添加的一种固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒存在于流动相中成为残渣。

        流动相通过0.45 µm微孔滤膜过滤对于从流动相中除去所有颗粒物是一个有效方法。0.2 µm微孔滤膜也可以用，但是它们就这个应用而言并不比0.45µm微孔滤膜更有效，而且它的过滤速度会更慢，特别是当实验室使用的试剂和水的质量不太好时。建议实验室在编写制定他们流动相制备标准操作程序（SOPs）时规定，可以借鉴国际上同类实验室的规定，即：

         流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤，反之所有流动相组成在使用前必须过滤。

        在连接储液瓶和泵的输液管的末端入口采用下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很重要的。这个过滤器的规格为≥10 µm的微孔物质，所以它不能取代流动相过滤步骤，但是它能除去系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的可靠性。

2、被测样品

        液相系统中的第二个颗粒物来源是被测样品。一些实验室在将他们的样品放置在自动进样器盘（或手动进样）以前，所有样品都先通过一个0.45 µm针筒式过滤器过滤。这是一个有效除去被测样品中颗粒物的方法。但是这个过程也有一点需要关注：你使用了针筒式过滤器就不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会有或多或少的丢失。丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。如果有丢失，过滤后液体中被测物的含量或浓度与原基本样液的含量或浓度还相同吗？这个问题一般需要通过实验确认。确认这步是要增加工作量和费用的。过滤器的使用是一种消耗，每个过滤器的价格从几元到十几元。但在做食品中残留物分析时，由于基质大多比较复杂，所以过滤这步已成为不可或缺的一步。在实际分析工作中，一般检测每一组样品会带一个外标、一个添加回收或是质控样品，所以，只要最终检测时得到的信噪比能满足检出限要求，可将这步视为系统误差而忽略。

3、仪器系统部件的磨损物

        最后，在HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。

        第一种建议认为，在一般实验室中输液泵密封垫通常使用寿命为六个月到一年，因此建议半年或一年更换这些密封垫，实验室应基于上述观点制定定期预防性维护计划。该观点认为：与输液泵密封垫颗粒堵塞柱子而更换新柱子的费用相比，更换密封垫的费用低些。一些输液泵有玻璃砂芯或筛网，可在流路中滤掉从泵密封垫磨损下来的颗粒物，防止这些颗粒物随流动相流至柱头。若有这种装置应查阅输液泵操作手册，查看推荐的这种过滤器清洗或更换的间隔。

       另一种建议则认为，原装密封垫的密封效果最好，更换以后容易引起流动相渗漏。所以，只要不漏液就不要轻易更换密封垫。

      两种说法都有其道理，具体如何操作，建议与仪器公司工程师沟通，各公司的仪器还是有些不同的。

     自动进样器旋转轴的密封随着使用时间也会磨损，但是在我的经验中，即便是高负荷的运转旋转轴密封垫也可以使用几年。如果你的自动进样器系统有计数进样阀转动次数的功能，你可以设定一个警铃当预设阀转动次数已达到时提醒你。曾有一种说法，进样器最多转动20,000次，这仅仅是进样10000个；但这似乎不是实验室涉及的常规样品分析使用寿命，它们的实际使用寿命会更长。旋转轴密封磨损后会渗液，比较明显的特征是同一样品多次进样后，峰面积值差别比较大（RSD>5%）。当然，输液泵的密封垫和旋转轴的密封垫磨损将增加更多研磨物在流动相中，加速对这些部件的损伤。此外，如果你日常运行的流动相有缓冲盐，如磷酸缓冲盐，密封垫的磨损会更快。

 

       无论颗粒物源于何物，实验时都要将其除去。推荐在HPLC系统中采用一个0.45或0.5 µm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如采用一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又方便（几分钟就可更换）。若采用在线过滤，HPLC系统检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升一定值，例如25%或增加500psi，应该更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。