使用：

　　头等大事：确认真空系统状态以及真空度

　　1.准备试样

　　1)装试样入HOLDER(样品台)，检查双O-RING。放HOLDER入测角台，开始预抽真空

　　2)在MONITOR下调到真空图的页面，便于确认真空系统动作顺序。

　　注意事项：

　　* 装样品时一定要小心!以免损坏样品、样品台。

　　*放HOLDER入测角台前，用HOLDER适当部位敲击手掌数次较好。

　　2.升高压

　　确认高压READY灯亮否?

　　1)手动升法

　　没有什么定式，原则：慢!安全!以自己喜欢的手法为好。

　　2)自动升法

　　其实和手动法一样，没有什么定式，也是以慢、安全为原则

　　A)设定高压为120kV。

　　B)按下 H T ON 按钮，确认暗电流，应为63µA左右。

　　C)自动升高压，选择目标电压，按以下方法运行：

　　120kV→160kV 时间：10分钟 等5分钟 (确认暗电流:83 µA左右)

　　160kV→180kV 时间：10分钟 等6分钟 (确认暗电流: 93µA左右)

　　180kV→200kV 时间：15分钟 等6分钟 (确认暗电流: 103µA左右)

　　注意事项：

　　** 升高压以安全为最高原则

　　3.发射电子束(出亮)

　　1)确认离子泵(SIP)和样品台预抽室的真空(绿灯亮否?)，将HOLDER放入镜筒中。

　　2)等离子泵的真空度回到原来的水平。

　　3)确认 FILAMENT READY灯亮(可以加灯丝)

　　4)按下灯丝加热钮，等电子束发射稳定

　　5)移动样品使得电子束能够到达荧光屏上，电子束发射即告结束

　　6)寻找样品位置(LOW MAG下比较好找样品位置)

　　4.合轴(使用前的简单合轴)

　　极不主张每次使用前都要按“安装时工程师所培训的合轴步骤”来合一遍轴。应该以有“亮”即使用，轴那里歪即合那里为原则。

　　但是有几点还是必须要做到，下面分述之：

　　1)灯丝亮度要足够

　　2)确定物镜(OL)焦距

　　按下右控制面板上的STD FOCUS，即恢复到标准的聚焦电压(参考一下出厂OBJ参数值)。

　　3)样品高度的确定

　　当物镜的焦距确定后，随后就需要来确定样品的高度，否则无法得到清晰的图像。

　　方法：调整样品台的高度(Z)，使观察样品的图像正焦。(用Image Wobbler检查聚焦情况较方便)

　　4)电压中心的确认

　　JEM-2100对于电压中心合轴的好坏比较敏感，所以需要大家时刻注意电压中心(放大倍数在100K以上时调整)

　　5)物镜像散

　　磁透镜的像散主要是和产生透镜聚焦作用的磁场分布、以及强度有关，所以改变相应的量后，就要随时校正物镜像散

　　6)欠焦、正焦、过焦三种状态的调整

　　* 以上各合轴步骤有严格的顺序关系，请大家注意。

　　5.拍照

　　1)在TEXT中输入底板信息。

　　2)做好第四步后，就可以进行在高倍(高分辨时在800K以上)寻找需要的信息，然后进行聚焦清楚。降低放大倍数进行拍照(高分辨在300K或400K)。

　　3)曝光方式可按自己的习惯选择，建议高倍下采用手动曝光，短时间的手动曝光可防止外界变化而引起样品的细节的变化。

　　6.关于底板

　　装片要正确、预抽时间要充分、每次电镜使用完毕后，最好能够将预抽好的50张新底板放入主机中，以备下一次使用。

　　7.使用结束(关闭电子束及高压)之前

　　将电镜设置为：

　　TEM模式: Mag X40K高压：200kV(经常使用)、 SPOT SIZE:1-3(经常使用的)。

　　用Shift X Y将合适大小的光斑放在荧光屏中心，然后再关灯丝及高压。等下次发射出电子束之前，不要改变相关的设置，以保证电子束发射出来后在荧光屏中心。

　　8.防污染装置ACD(Anti-Contamination Device)的使用

　　如果所观察的样品怕污染，最好将ACD Tank中放入液氮。

　　使用液氮时有几点需要注意：

　　1)何时加液氮到ACD Tank中 (大约需要小时数量级的稳定时间，如果做高分辨尤其须注意其稳定问题) 。

　　2)为节省液氮需要将ACD Tank的入口以及颈部和空气尽量隔开。

　　3)中午休息前将ACD Tank中加满液氮，防止下午使用中液氮蒸发干净，出现异常。

　　4)试验做完以后，一定记住把液氮用ACD Heater烤干，以防止液氮自然挥发后，因为冷指温度升高放出大量气体，造成离子泵(SIP)负担过重而保护性停止工作。使真空系统工作异常。

　　检查清单：

　　编号 检 查 项 目 周 期

　　1. SIP的真空度 每天注意

　　2. 空压机的启动频率以及运行噪音 每天注意

　　3. 主机机械泵的运行噪音 每天注意

　　4. 底板干燥器的运行噪音 每天注意

　　5. 循环水的运行噪音 每天注意

　　6. HOLDER的两个O-RING的清洁度 每天注意

　　7. 高压200kV时的暗电流 每天注意

　　8. 循环水的温度、压力、水量以及水的清洁度 每月1号

　　9. 循环水散热器的清洁度 每月1号

　　10. 主机稳压器的输出电压 每月1号

　　11. 主机机械泵油量(太多或太少均不可) 每月1号

　　12. 底版干燥器机械泵油量(太多或太少均不可) 每月1号

　　13. 空压机放水 每月1号

　　14. 高压箱SF6 气体的压力 每月1号

　　15. 电子枪SF6 气体的压力 每月1号

　　16. 主机压缩空气过滤器放水 每月1号

　　17. 检查镜筒(COL) PI 1值 每月1号

　　18. 检查电子枪(GUN) PI 2值 每月1号

　　19. 检查照相室(CAM) PI 3值 每月1号

　　20. 检查样品预抽室(SPC) PI 4值 每月1号

　　21. 检查缓冲灌(RT) PI 5值 每月1号

　　22. 灯丝像 每月1号

　　23. BAKE OUT 根据需要做

　　平常做透射电镜实验所用的铜网，即为承载样品的载网。载网若是铜材质，就称铜网，如果是镍、钼、金、尼龙，就相应的称镍网、钼网、金网、尼龙网等。

　　单独使用载网，也称“裸网”。主要应用在生物制样中，可配合切片机，在水槽中用“裸网”捞取样品。再进行喷碳或喷金处理，然后进入电镜观察。大多数透射电镜样品在制样时，为了确保样品能搭载在“载网”上，会在“载网”上覆一层有机膜，称为“支持膜”。这种具有支持膜的载网，称为“载网支持膜”。当样品接触载网支持膜时，会很牢固的吸附在支持膜上，不至于从载网的孔洞处滑落。以便在电镜上观察。

　　当样品放在电镜中，“载网支持膜”会被电子束照射，有机支持膜上就会产生电荷积累，也会引起样品放电，发生样品飘逸、跳动、支持膜破裂等情况。所以，人们考虑在支持膜上喷碳，提高支持膜的导电性，达到良好的观察效果。这种经过“喷碳的载网支持膜”，简称“碳支持膜”，一般膜厚度为7-10nm。

　　从制作成本和使用效果看，铜网最经济实用，所以被普遍采用。因此，人们经常提到的“铜网支持膜”、“碳支持膜”、“碳膜”、“方华膜”等，甚至被称为“铜网”，大多是指这种具有“铜网喷碳的支持膜”。通常称“碳支持膜”。准确的说，微栅是支持膜的一个品种，它是在制作支持膜时，特意在膜上制作的微孔，所以也叫“微栅支持膜”，它也是经过喷碳的支持膜，一般膜厚度为15-20nm。它主要是为了能够使样品搭载在支持膜微孔的边缘，以便使样品“无膜”观察。无膜的目的主要是为了提高图像衬度。所以，观察管状、棒状、纳米团聚物等，常用“微栅”支持膜，效果很好。特别是观察这些样品的高分辨像时，更是最佳的选择。

　　测试中捞样品常用的有碳支持膜和小孔微栅，小孔微栅上其实也有一层超薄的碳膜。拍高分辨的，试样的厚度最好要控制在 20 nm以下，所以一般直径小于20nm的粉体才直接捞，颗粒再大则是包埋后离子减薄。

　　超薄碳膜，也是支持膜的一种。它是在微栅的基础上，叠加了一层很薄的碳膜，一般为3-5nm。这层超薄碳膜的目的，是用薄碳膜把微孔挡住。既然微栅观察效果最好，为什么还要把孔挡住呢?这主要是针对那些分散性很好的纳米材料，如：10nm以下的样品，分散性极好，如果用微栅就有可能从微孔中漏出，如果在微栅孔边缘，由于膜厚可能会影响观察。所以，用超薄碳膜，就会得到很好的效果。

　　实际上实验室用的多的就是文中提到的喷了碳的微栅网了，一般承载样品的空洞只有数个微米大，而小孔微栅的空洞更是只有零点几个微米。不同厂家生产的铜网尺寸可能有所不同，图中所示的空洞是构成铜网的孔，实验中并不是靠它来承载样品，它的制作方法没有见过相关资料，可能只有生产厂家知道。

　　1.前言

　　随着纳米科学技术的不断发展以及传统物理学、材料学的不断完善，人们亟需更加深刻地认识、了解微观世界。透射电子显微镜是研究物质微观世界的强有力工具之一，它可以帮助人们取得高放大倍率、高空间分辨率的结构信息和化学组成。

　　透射电镜早期的发展步伐是较慢的，但从1980年代中后期，特别是进入1990年代后期，电镜的发展进入了一个快速发展的时期。这主要得益于电子技术、真空技术、计算机技术等的飞跃式发展。现代透射电镜尽管其基本组成结构、基本工作原理未发生本质上大的变革，但其主机系统各组成部分的稳定性大大提高，因而现代电镜的综合稳定性较早期的电镜好很多。再结合新的计算机技术，透射电镜的控制和操作变为全数字化、全电脑控制，现代电镜的性能得以显著提高。这一点体现在：得到一张高分辨透射照片现在非常容易;在材料分析中，电镜主机和能谱仪等分析性附件可以十分方便地相互配合。透射电镜在材料科学中应用越来越广泛。

　　2.透镜的特点及应用

　　2.1组成与原理

　　现代透射电子显微镜是由电镜主机以及各种附件的有机组合。其中，主机部分由电子枪、镜筒、样品台、照相系统、高压系统、真空系统及电镜控制系统等核心部分组成。现代透射电镜根据应用要求不同，将最高加速电压设计为120kV、200kV和300kV，这三种高压是材料研究中最常用的。镜筒中最核心的部分是物镜，根据应用要求可以选择不同的物镜。

　　透射电镜的基本工作原理是：以电子束作为光源，用电磁透镜对入射电子所穿透的样品聚焦成像，获得样品结构信息。据此，透射电镜首先作为一个放大镜和电子衍射仪。从放大镜的角度来看，在较低的放大倍数时，主要观察样品的形貌，在高倍时可以得到高分辨照片，不同情况下需要用不同的衬度原理来解释，这往往需要非常专业的电子光学知识。由于透射电镜上得到的高分辨照片往往受到各种因素，比如物镜的球差、样品的厚度不均一性等的影响，对高分辨照片的解释有时是很困难的。这就要求分析者必须结合透射电镜的分析功能来辅助分析和判断。现代透射电镜除了在高分辨性能上着力发展外，在分析能力上也表现出了传统透射电镜不可比拟的优越性能，因此，对新材料的研发起着不可替代作用。

　　2.2特点

　　透射电镜以电子束作为光源，用电磁透镜对入射电子所穿透的样品聚焦成像，获得样品结构信息的电子光学仪器。众所周知，图像观察、结构研究等各种基本功能都是由透射电镜的主机提供的。然而，一些功能的实现要靠电镜主机与附件之间的有机配合来完成的。如，微区的成分分析就需要EDS附件和电镜的纳米束斑模式进行配合才可以实现。在高度数字化的今天，CCD相机在很多时候可以代替胶片采集透射电子信号进行数字成像及完成一些简单的图像分析功能，也成为了透射电镜不可或缺的主要附件之一。再者由于透射电镜只能对直径为3毫米、厚度在100纳米以下的样品进行较好的分析研究，因此一些附属制样设备也是必须的，特别是对研究一些块状的材料。

　　作为一台现代电镜，除了要求仪器有良好的分辨本领外，其分析功能则更加受到使用者青睐，并在实际工作中更为实用。特别是对于钢铁企业来说，分析晶界、沉淀相的成份及含量是工作中需要经常处理的任务。现代透射电镜在提供高分辨率图像的同时，还能与EDS及CCD附件同时采集数据，在提供TEM及STEM像时，同时可以根据需要给出成份组成及含量的分析数据。并实时显示在显示器上，同步进行，是完全准确的一一对应关系，直观高效。

　　一般来讲，材料科学用户多选择200kV以上(含200kV)的电镜，他们追求图像的分辨率和纳米尺度的成分、晶体结构分析(加速电压越高、分辨率越好);生命科学用户多选择100kV、120kV的透射电镜，他们更看重或追求图像的衬度(加速电压越低、衬度越好)。但研究领域不同，也不能一概而论。

　　场发射透射电镜与六硼化镧型透射电镜的比较，场发射透射电镜的分辨率没有提高(因为球差系数没有变化)，优点是亮度高(场发射枪的亮度是六硼化镧枪的100倍，钨灯丝枪的1000倍)、电子的能量发散度小和相干性好。

　　空间分辨率高(亮度)是场发射透射电镜的突出优点，利用场发射枪高亮度的特点，可进行高空间分辨率的观察，即在很小的束斑尺寸下(例如：束斑尺寸为0.5nm时)，进行晶体结构(微微电子衍射)和成分分析，纳米材料、材料的界面和表面(通常尺度很小)是当前材料科学研究的热点，场发射透射电镜高空间分辨率的特点正好满足了材料工作者的需求，这也是近年来透射电镜需求旺盛的原因之一;需要指出的是，尽管场发射透射电镜的空间分辨率优于六硼化镧型透射电镜，但他们的图像分辨率(区分开两点之间的最小距离)却是相同的，图像的分辨率主要与加速电压和物镜的球差系数有关，目前，同一个加速电压下，场发射电镜和六硼化镧电镜的球差系数相同，因而图像的分辨率也相同。

　　场发射透射电镜的另外一个特点就是，可以与许多分析系统配合使用，如能谱仪系统(EDS)、能量损失谱系统(EELS)、能量过滤系统(Energy Filter System)、HAADF(High Angle Annual Dark Field)分析系统等等，因此，整个系统相对庞大一些;对于六硼化镧电镜，原则上，我们不太推荐能量损失谱系统(EELS)、能量过滤系统(Energy Filter System)、HAADF(High Angle Annual Dark Field)分析系统，一般只配备能谱仪系统(EDS)。

　　2.3钢铁方面应用

　　现代透射电镜能在原子和分子尺度直接观察材料的内部结构(高分辨像);在对复杂成分材料开展形貌观察的同时，进行原位化学成分及相结构的测定与分析;也可以对结构复杂的金属等传统材料进行形貌观察、测定成分(定性定量分析)、微相表征、结构鉴定等多功能对照分析;还可以将图象观察、高分辨研究，EDS微区成分分析、会聚束衍射、选区电子衍射，衍衬分析等各种方法综合应用在具体研究中。

　　对于利用传统电子显微学方法对钢铁领域中问题的研究，如利用电子衍射、衍衬、高分辨等显微学方法进行的缺陷及结构的研究，现代透射电子显微镜都能满足。除此外，现代透射电子显微镜能提供更高的TEM分辨率合STEM分辨率。特别是高分辨的STEM可以轻松得到可直接解释的原子像。由于STEM的高分辨本领，使用者已经不需要高深的电子显微学知识，即可给出像的解释，因为STEM给出的是简单的衬度像，它不象TEM像在其高分辨像中既包含有振幅衬度信息又包含相位衬度信息，需要进行复杂的数学计算来进行像的解释。而且由于STEM像没有相位衬度，对于钢铁企业经常涉及的分析晶界原子排列及沉淀相分析更是方便快捷。

　　随着现代科学技术及工业水平的发展，对钢铁的性能也提出了更高的要求，使钢铁生产的工艺及掺杂也越来复杂。钢铁的很多性能都决定于纳米或更小尺度范围内物质结构、成分组成、掺杂元素的分布形式及状态、晶粒大小及晶粒界面的具体结构等。对这些小尺度范围内的物质结构、成份组成及分布进行鉴定和表征需求使得分析电子显微学成为了钢铁中微结构分析的主要方法。传统上，透射电镜在钢铁材料中应用主要有：

　　(1)钢铁材料微观组织形貌的观察。例如，基于对合金元素在热机械加工中的作用、变化及热加工对组织影响规律的认识，可以更深入理解材料的性能;(2)位错、各种缺陷的观察(3)析出相的观察，形态、大小、分布，并结合能谱进行成分分析;(4)电子衍射进行微区的取向、晶体结构分析，并结合能谱进行成分分析;(5)相界面的观察和分析。

　　3磁屏蔽技术

　　钢铁企业的输配电所产生的磁场一般称为低频磁场，低频磁场对电子显微镜等精密仪器有强烈的干扰。济钢技术中心08年引进的FEI 公司 “TECNAI G2 F30S-TWIN”型号的场发射透射电镜。因为透射电镜实验室的电磁场超标，需要进行电磁屏蔽技术来达到要求。

　　众所周知，低频电磁屏蔽与一般的电磁屏蔽不同，使用铜网或者铜板是完全无效的，必须采用具有一定厚度的钢板等高导磁材料，按照特殊的施工要求，才能保证达到满意的效果。减小低频电磁干扰的有效方法是采用低频电磁屏蔽。

　　低频电磁屏蔽就是依据磁路并联旁路分流的屏蔽理论，通过采用高导磁材料(如低碳钢板)提供磁旁路来降低屏蔽室内部的磁通密度，同时尽量增大涡流损耗，使一部分能量转化为热能消耗。

　　目前国内能进行透镜低频电磁屏蔽施工的单位并不多，经过考察，济钢透镜实验室的电磁屏蔽是由安徽建永公司完成，该低频磁屏蔽安装工程一次通过FEI公司的验收，无需任何整改，其技术达到了国内领先水平。

　　4.结束语

　　透射电子显微镜是唯一的一种能同时观察空间频率空间(倒易空间) 和真实空间的仪器，是研究物质微观世界的强有力工具之一，它可以巧妙地把空间频率空间 (倒易空间) 和真实空间相对应或结合，来揭示宏观现象与介观和微观(原子尺度) 结构及组织间的关系，它是研究钢铁材料、纳米等材料科学方面不可缺少的工具，其作用越来越重要。

　　作者简介：夏茂森(1967—)，男，汉族，山东临沂人，硕士，高级工程师，现为济钢技术中心中试基地主任，山东省理化分析测试协会理事，山东测试分析学会电镜专业委员会副主任委员。

　　电子显微镜

　　目前，电子显微镜技术(electron microscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段。常用的有透射电镜(transmission electron microscope，TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。

　　成像原理

　　1.透射电镜技术

　　透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片(通常为50～100nm)。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。要在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小(1立方毫米以内)，常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋,用特制的超薄切片机(ultramicrotome)切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。

　　电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高(electron dense)。反之，则称为电子密度低(electron lucent)。

　　2.扫描电镜术

　　扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。(细胞、组织)表面的立体构像，可摄制成照片。

　　扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定，经脱水和临界点干燥后,再于样品表面喷镀薄层金膜，以增加二波电子数。扫描电镜能观察较大的组织表面结构，由于它的景深长，1mm左右的凹凸不平面能清所成像，故放样品图像富有立体感。

　　图1 透射显微镜构造原理和光路

　　(a)透射电子显微镜; (b)透射光学显微镜

　　图1 为透射电子显微镜和光学显微镜的光路系统示意图。两者的光学成象原理是相同的。透射电镜和光学显微镜之间的差别主要有下列几个方面：

　　(1) 透射电镜的照明光源是电子束，光学显微镜的照明光源是可见光;

　　(2) 透射电镜是用电磁透镜来聚焦的，而光学显微镜是用玻璃透镜来聚焦;

　　(3) 透射电镜的物镜和投影镜(相当于目镜)之间装有一个中间镜，中间镜的引入不仅可以调节放大倍数，而且可以进行电子衍射操作;

　　(4) 透射电镜中电子束形成的象只能在荧光屏上才能显示出来，而光学显微镜中可见光形成的象是在毛玻璃或白色屏幕上显示出来。

　　(5) 为使电子能自由运动，不受与气体分子碰撞的影响，电子显微镜镜筒内必须保持很高的真空。

　　透射电子显微镜由电子光学系统、电源与控制系统及真空系统三部分组成。

　　电子光学系统通常称镜筒，是透射电子显微镜的核心。它分为三部分，即照明系统、成像系统和观察记录系统。图2是JEM -2101F 透射电子显微镜的外观和镜筒剖面示意图。

(a)

(b)

图2 JEM -2101F 透射电子显微镜外观和镜筒剖面示意图

　　一、照明系统

　　照明系统主要由电子枪、聚光镜、电子束平移和倾斜装置组成。其作用是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明源。为满足明场和暗场成像要求，照明束可在2～3º范围内倾斜。

　　(1)电子枪

　　电子枪是发射电子的照明光源，它实际上是一个由阴极、栅极和阳极组成的静电透镜。如图3所示，电子枪的阳极接地，阴极加上了负高压(-50~200kv)，栅极加上比阴极负几百至几千伏的偏压。电子枪为一个自偏压回路，起限制和稳定束流的作用。

(a)自偏压回路 (b)电子枪内的等位面

图3 电子枪

　　(2)聚光镜

图4 双聚光镜的原理图

　　聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，减小样品被照射面积，调节照明强度、孔径角和光斑大小。现在高性能的电子显微镜一般都采用双聚光镜系统，如图8-4所示。第一聚光镜是强激磁、短焦距的透镜，可将电子枪光斑缩小10~50倍;而第二聚光镜是弱激磁、长焦距透镜，适焦时放大倍数为2倍左右。如果电子枪第一交叉点的光斑直径为50μm，在样品平面上可获得2~10μm的照明电子束斑。双聚光镜系统还使得在第二聚光镜与物镜之间有足够的空间来安放样品台和其它附件。

 

　　二、成像系统

　　成像系统主要由物镜、中间镜和投影镜组成。

　　(1)物镜

　　物镜是最关键的透镜，用来形成样品的第一次放大象。物镜是一个强激磁、短焦距(f=1~ 3mm )的物镜，放大倍数较高，一般为100 ~300倍。

　　透射电子显微镜分辨率的高低主要取决于物镜的质量。物镜的分辨率主要取决于极靴的形状和加工精度。一般来说，极靴的内孔和上下极靴之间的距离越小，物镜的分辨率越高。目前高质量的物镜分辨率可达0.1nm。

　　(2)中间镜

　　中间镜是一个弱激磁、长焦距的变倍透镜。中间镜的作用有2个：

　　(1) 调节放大倍数。电子显微镜的总放大倍数是各级透镜放大倍数的乘积，在电镜操作过程中，通过改变中间镜的放大倍数(0~20倍)可以在相当大的范围内(如2000~200000倍)改变电镜的总放大倍数。

　　(2) 选择透射电子显微镜中的成像操作和电子衍射操作。如图8-5所示，如果中间镜的物平面和物镜的象平面重合，则在荧光屏上得到一张清晰的放大象，这就是电子显微镜的成像操作;如果中间镜的物平面和物镜的后焦面重合，则在荧光屏上得到的是一幅电子衍射花样，这就是透射电子显微镜中的电子衍射操作。成像操作和电子衍射操作的转换，是在固定中间镜的象距L2不变的情况下，通过改变中间镜的激磁电流而改变焦距f来实现的。

高倍放大 (b)电子衍射

图5 成像系统光路

　　(3)投影镜

　　投影镜的作用是把经中间镜放大(或缩小)的象(或电子衍射花样)进一步放大，并投影到荧光屏上。它是一个短焦距的强激磁透镜，它的景深和焦长都非常大。

 

　　三、观察和记录系统

　　观察和记录系统包括荧光屏和照相装置，在荧光屏下面有一个可以自动换片的照相暗盒。照相时只要将荧光屏垂直竖起，电子束即可使照相底片曝光。由于透射电子显微镜的焦长很大，虽然荧光屏和底片之间有数十厘米的间距，当荧光屏上观察到的图象聚焦清楚时，仍能保证底片上的图象清晰。

　　电子显微镜工作时，整个电子通道都必须处于真空中。新式的电子显微镜中电子枪、镜筒和照相室之间都装有气阀，各部分都可单独抽真空，因此在更换灯丝、清洗镜筒和更换底片时，并不破坏其它部分的真空状态。

　　电源和控制系统主要包括三部分：灯丝电源和高压电源，使电子枪产生稳定的高能照明电子束;各电磁透镜的稳压稳流电源，使各电磁透镜具有高的稳定度;电气控制电路，用来控制真空系统、电气合轴、自动聚焦、自动照相等。

　　肝为五脏之一，主疏泄、藏血，在人体生理和病理活动中起着重要的作用，因而倍受重视。肝病，包括各类肝炎、肝硬化、肝癌等是我国的多发病。因此，掌握肝组织的电镜研究方法对中医实验研究很有必要。

　　一、原理

　　人或动物的肝组织属柔软含水物体，在一般的电镜下，不能直接观察;也不能作超薄切片。超薄切片技术就是通过固定、脱水、浸透、包埋使之成为坚硬的固体而能在超薄切片机上进行超薄切片。而且在整个制样过程中，又不能使肝组织细胞原来的结构遭受破坏。

　　另外，肝组织和其他生物组织一样，主要是由较轻的低原子序数的原子如碳、氢、氧、氮等元素所组成，肝组织样品中的这些原子，其电子散射能力很小。而且样品被切成菲薄的切片(一般为50～70nm)，电子散射能力更弱，反差很低，无法摄得对比度清楚的电镜照片。在样品制备过程中用重金属进行染色，就是要提高样品的散射能力。

　　二、实验准备

　　1.器材

　　存放电镜标本的小瓶子(一般用青霉素瓶)

　　眼科手术剪刀、镊子

　　剃须刀片

　　玻璃吸管

　　玻璃量筒、玻璃烧杯

　　塑料小砧板

　　牙签

　　大小广口玻璃瓶(存放锇酸固定液的必须是棕色瓶)

　　天平、称量纸

　　pH酸度计

　　存放洗涤液、缓冲液、脱水剂所需的洁净玻璃瓶(容量500ml以上)

　　磁力棒、磁力搅拌机

　　微量OT针筒

　　搪瓷浸透盘

　　定向包埋模板

　　胶囊及胶囊架

　　电热吹风机

　　隔水恒温烤箱(37℃及60℃两种)

　　吸水纸

　　超薄切片机及其附属设备

　　超声波清洗设备

　　修块机和制刀机

　　特制玻璃条(制玻璃刀用)

　　玻璃刀或钻石刀

　　金属载网

　　专用镊子

　　滤纸

　　培养皿

　　双筒显微镜

　　载玻片

　　棕色广口玻璃瓶(容量500ml以上，存放铀染液用)

　　50ml的专用容量瓶(存放铅染液用)

　　牙科用红腊片

　　塑料小盒

　　透射电镜及其附属设备

　　2.试剂

　　2%戊二醛(Glutaraldehyde，C5H8O2)固定液(作前固定用)

　　0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)92ml

　　25%戊二醛原液8ml

　　存放于4℃冰箱保存。

　　2%锇酸(Osmium Tetroxide，OsO4)水溶液(母液)

　　锇酸1g

　　双蒸水50ml

　　配制于棕色磨口玻璃瓶内。存放于4℃冰箱保存。

　　1%的锇酸固定液(作后固定用)

　　0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液1份

　　2%的锇酸水溶液母液1份

　　存放于4℃冰箱保存。

　　0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液(母液)：

　　二甲砷酸钠42.8g

　　氯化钙1.0g

　　双蒸水加至1000ml

　　0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液

　　0.2mol/L二甲砷酸钠缓冲液(母液)250ml

　　双蒸水250ml

　　最后用1 N HC1 将pH调至7.4，存放于4℃冰箱内保存。

　　洗涤液(0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液)

　　脱水剂： 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇

　　环氧丙烷

　　70%的乙醇醋酸铀饱和液

　　包埋剂

　　618环氧树脂(国产)4.5 g

　　十二碳烯基丁二酸酐(DDSA)3.5g

　　邻苯二甲酸二丁酯(DBP)0.35 g

　　2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚(DMP-30)0.075 ml

　　(在上三药品充分拌匀后，缓慢点滴加入)。

　　0.5%聚乙烯醇缩甲醛(Formvar )液(氯仿配制)

　　铀染色液： 70%乙醇醋酸铀饱和液(醋酸铀或醋酸双氧铀一定量溶于70%乙醇中，以出现不能溶解，发生沉淀为度)。

　　铅染色液：柠檬酸铅(或叫枸椽酸铅)染色液

　　硝酸铅[Pb(NO3)2]1.33g

　　柠檬酸钠[Na3(C6H5O7)·2H2O]1.76g

　　双蒸水30ml

　　将以上悬液盛于有刻度的50ml容量瓶中，激烈地不断地摇动30分钟后，加入8ml新鲜配制的1N的NaOH，此时乳白色的混浊液立即变为无色透明溶液，再用双蒸水加至50ml后备用。该染色液的pH为12，可保存数月。

　　3.实验材料

　　大鼠肝

　　碎冰

　　三、实验步骤

　　1. 取材

　　断头处死大鼠，迅速取出肝脏，用锋利剃须双面刀片切成大小为1mm3的肝组织，快速将组织浸入固定液，最好不要超过3分钟。

　　2.固定

　　(1)将肝组织块投入2%戊二醛固定液中，在4℃下作前固定1～2小时，固定液用量不宜少于组织块体积的40倍。

　　(2)在4℃下用二甲砷酸钠缓冲液或洗涤液洗涤漂洗2小时(4℃)或更长时间，中间换液数次(至少三次)。

　　(3)然后在4℃下用1%锇酸固定1.5～2小时。

　　3.脱水

　　将组织依次放入30%、50%乙醇、70%的乙醇醋酸铀饱和液(以上均为0℃～4℃)各约10分钟(最后一步，可置于冰箱过夜);再依次放入80%、90%、100%、100%乙醇(室温)各约10分钟。

　　4.浸透

　　组织块移入环氧丙烷20分钟;再用环氧丙烷和包埋液按1：1混合浸透1～2小时(37℃)，再进入纯包埋液中浸透2小时，室温浸透(中间换一次包埋液)。

　　5. 包埋

　　(1)用牙签棒将组织块从上述浸透液中转移到胶囊底部或包埋膜板槽的顶部，然后用包埋液把胶囊或模板槽灌满。把写好标本编号纸卷成环状放在胶囊的上部，或放在模板槽内。

　　(2)将装有组织块的胶囊或模板放在37℃温箱中浸透4小时或过夜。

　　(3)然后再转入到60℃温箱，放置48小时，使其聚合。硬化后从温箱中取出，让其自然冷却。

　　6. 超薄切片

　　(1)包埋块的修整

　　组织块的修切对于超薄切片有很大影响，原则上组织块修得越小，切片越能够切得薄。

　　在许多情况下，常需要先切一些面积较大的厚切片(半薄切片)在光学显微镜下检查，然后考虑选取某些细胞或组织块某一部分作超薄切片。这样可以将组织块修切到0.5mm2或者稍大的面积。目前多半采用徒手修块法。把组织包埋块园端朝上装进样品夹上，放在双筒解剖镜下，调好灯光，一手紧持样品夹，一手拿新的刀片，先在包埋块的顶端平切一刀，露出组织，然后再在组织的四周以和水平面成45°的角度切四刀。这时组织面可稍为大些，以便切取半薄切片(0.5～2.0μ)，在相差显微镜下检查或染色观察之后，进一步定位进行超薄切片，定位后再修切至所需的尽可能小的组织切面。

　　组织块的形状可以直接修成正方形、长方形或梯形。

　　手工修块虽简便迅速，但准确性较差，表面也不够光滑平坦。近年来已有商品修块机出售，它们可保证锥体四面彼此精确地互相垂直，有助于切出高质量的超薄切片。

　　(2)金属载网的准备及支持膜的制作

　　常用的载网有铜网、不锈钢网、还有用镍、铂、尼龙等组成的载网。一般常用铜网，其它的常在某些电镜的组织化学实验中使用。

　　支持膜用Formvar(学名为聚乙烯醇缩甲醛)制作。先用氯仿配制成浓度为0.5%的制膜液，用干净的载玻片浸入该液中静置片刻，取出后垂直放在一滤纸上使多余的溶液流干。用锋利刀片或小针头沿膜的四周划一刻痕，小心将膜漂浮于水面上，再把载网排列膜上，用滤纸轻轻捞起晾干备用。制膜时室内相对湿度要求在60%以下，如湿度太大，容易在膜上出现微孔。Formvar具有较好的机械强度和透明度，但formvar膜在电子束轰击下易发生变形或小部分发生分解，为此，在高分辨工作中，经常要再喷涂上一层碳膜加固。

　　(3)制玻璃刀

　　当前用于超薄切片的刀有钻石刀和玻璃刀。前者坚硬耐用，但价格昂贵。后者价格便宜，易于制作，可以制出很锐利的刀刃，因此受到最普遍的使用。

　　玻璃刀的制作有手工和机制两种方法。手工制刀时，首先选择厚约5～6mm、内应力小、从断面观察呈淡黄色、白色或略带绿色的硬质玻璃，用钻石玻璃刀把洗净过的玻璃制成2.5×2.5cm或3.0×3.0cm的正方形小块;然后从近乎对角的部位(距边缘约0.5mm)划一条约45°角的直线，再用平口钳平行地夹住对角线的两边，向相反的方向拉成两块刀，其中成45°锐利的一块便是所需的玻璃刀。在双筒解剖镜或低倍显微镜下检查，刀刃平整光滑，无锯齿状波纹者为适用。

　　(4)刀槽及液面的调节

　　超薄切片只有漂浮在水面上或其他合适的液面上才便于收集、伸展和捞取，为此在刀口背部装上一个小的水容器，通常称为“刀槽”。通常用定制的硬塑料刀槽架或用一小段医用橡皮胶缠绕过刀背，紧紧地粘在玻璃上，橡皮胶的后下部分用融化的牙科用红腊密封，以防漏水。注意橡皮胶的顶端不应高出刀刃。

　　切片前在刀槽内加入双蒸水，使切后的切片漂浮于液面上。液面的调节一般先加稍过量的液体使之凸起，以保证浸湿刀刃。然后在双筒解剖镜下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液体，调整照明系统，当液面变成凹面、可见一反射光线的弧面，即为正确的液面。从这一光亮的反射光可看到切出的片子。在切片过程中由于液体蒸发，需加液以保证正确的液面。

　　(5)超薄切片

　　切片时将夹着修好组织块的样品夹安装在切片机的样品臂上，刀台上装好玻璃刀，其高度要与刀台上的标准规等高，后斜角一般在3～5°，在显微镜下使样品块面的上下两条平行边与刀刃平行，如是梯形的应长边在下面。调整好刀刃和组织块的距离，再在刀槽内注入适量的双蒸馏水。将切速放在2～5mm/秒，调节控制切片厚度的电流表，即可切片。当切片停止时，立即打开电吹风，冷却样品臂。捞片后关掉电吹风又可重新切片，或更换新刀。

　　切片厚度的判断。一般是利用反射光干涉色来判断切片的厚度，即从切片表面反射的光和从切片下面的水面的反射光发生干涉现象(见下表)。当用白光时，从双筒显微镜下观察两种光线间的差别。

　　目前公认的树脂包埋切片厚度与干涉色的近似值

干涉色	切片厚度
暗灰色	40nm以下
灰色	40～50nm
银白色	50～70nm
金黄色	70～90nm
紫色	90nm以上

　　紫色切片太厚，电子束不易穿过，故不适用于电镜观察用。金黄色切片其分辨率也比较低。目前一般认为银白色的切片是较理想的厚度，其分辨率可达2.5nm左右。也有人喜欢采用金黄色切片，尤其在细胞化学、放射自显影中较适宜。

　　切片的展平和捞取。在切削过程中，由于切片很薄，经挤压使切片发皱，甚至引起标本结构变形。为此，常用沾有氯仿或二甲苯的滤纸小片移近刀槽液面，试剂挥发性蒸汽可使切片软化伸展。蒸发时间2～3秒钟即可，不能把试剂滴入水槽。

　　捞片时，可用眼睫毛做成的小针把切片轻轻地拨离刀刃，并按需要把切片带分成几段。再用弯头的小镊子夹住铜网的边缘，有支持膜的一面向下，与切片轻轻接触，使切片贴附在铜网的膜上，轻轻提起并把膜面朝上，放于培养皿中无毛的滤纸上，待干经染色后即可电镜观察。

　　7.电子染色

　　预先取一个清洁的培养皿或塑料小盒，内放干净的牙科用的石腊片(先切好长条形)。染色时，加1至数滴铅染色液于腊片上，用镊子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，或者倾斜地轻轻插入染液中，盖上培养皿和塑料盖。在室温条件下，染色数分钟～10分钟左右。载网从染液中取出后，必须尽快进行仔细清洗，以防染液蒸发沉淀，同时要避免呼吸直接对准载网，因人呼吸中含有大量的CO2，极易与铅发生化学反应而产生铅颗粒沉淀，污染切片。在放有双蒸馏水的数个小烧杯中，漂洗数次，常用镊子夹着载网清洗，除去载网上残留液然后用小滤纸条充分吸干。用镊子夹着载网清洗时，含在二尖之间的液体，可能会污染别的溶液或超薄切片，必须十分注意。因此在清洗完毕吸干时，用小滤纸条伸入二尖间隙内把液体吸干。

　　8.电镜观察

　　四、实验结果

　　肝细胞为组成肝脏的主质细胞，其数量和体积约占肝实质的80%。肝细胞为多边形，是高分化的细胞，有各种发达的细胞器，常作为细胞学研究的模式。肝细胞直径一般为20~30μ，常随生理、病理状态而改变其大小。位于肝小叶不同部位的肝细胞，其大小也有差别。每个肝细胞有三个面，窦周间隙面、肝细胞面和毛细胆管面。电镜下，正常肝细胞的超微结构几乎具备各种细胞必须具备的的特点，即主要由细胞质膜、细胞质(含各种各样的细胞器)及细胞核等构成。

　　细胞质膜又称生物膜，它包括两部分内容，一是指细胞与外环境之间的界膜，它构成细胞与外环境间的重要屏障;二是指细胞内各种细胞器间(包括细胞核)的界膜。电镜下，细胞质膜经锇酸染色后，呈内外两层电子致密，中间夹有一层透亮层(常称两暗层夹一明层)。每层厚约3nm，三层总厚度为9～10nm。

　　细胞质中有各种各样的细胞器。如核糖体，电镜下为无包膜的电子致密的小颗粒，略呈圆形或椭圆形，平均直径约15～25nm，通常散在分布于细胞质中或附着于内质网上。粗面内质网(简称RER)在电镜下呈扁平膜囊状、小管状或囊泡状结构，在其膜胞质溶胶面有核糖体附着，RER膜厚约6nm，RER膜所包围的囊腔称为RER池或RER腔。光面内质网(简称SER)在电镜下呈小泡状或短管状;也有呈长管状，但较少见;膜的厚度常小于6nm，表面无核糖体附着。高尔基体在超高压电镜下，低倍观察厚切片，整个高尔基体表现为单个网络结构，由波浪形带状或板状结构相互连接成弓形、半球形或球形;高尔基体通常位于细胞中央部位并向四周或某一特定方向伸展，偶而可延伸到质膜下。线粒体在电镜下为双层单位膜包围而成的封闭囊状细胞器，其最外层膜为外膜;里面有内膜，内膜向内折叠形成许多嵴;内外膜之间的腔隙为外腔;内膜所包围的腔隙为内腔。细胞质中还有如溶酶体、微体、中心体、微管和微丝等细胞器，以及胞质内涵物如脂滴等。

　　细胞核通常位于中央，呈圆形或卵圆形。核的最外层为核外膜、核内膜;内外膜之间的间隙为核周间隙;内外膜的融合处为核孔;细胞核中充满着常染色质和异染色质，异染色质常呈团块状，染色较深，常染色质因染色浅淡而难分辨;中间有一个或多个核仁，其电子密度较高，外围无膜包绕。代谢旺盛时，异染色质明显减少;蛋白质合成功能活跃时，核仁可边集。

　　五、注意事项

　　1.取材时注意事项

　　对任何组织或细胞来说，以下几点要记住：

　　(1)快。所取材料尽量保持其生活时的状态，这就要求从麻醉或处死的动物身上取材时操作必须快速力争在处死动物后1分钟内将组织浸入固定液。最慢也须在3分钟内完成。在操作者的头脑中要有这样一个概念：瞬刻的时间差别就会引起超微结构的变化。

　　(2)小。组织块不大于1mm3。这是由于电镜中使用的固定剂穿透力较弱，如锇酸中浸透组织1～1.5小时仅能穿透平均0.3mm，所以要求组织块尽可能切成0.5mm薄。虽然醛类穿透力快一些但也不宜于超过1mm。否则，组织过大的话在外周的组织可以得到良好的固定，而在中央部位的组织由于固定剂不能透入而得不到及时固定，会发生细胞自溶现象。所以组织块宜小容易固定。

　　(3)4℃低温操作。动物组织的血液供给停止后，会发生自溶现象，这是因为组织和细胞内的各种酶，尤其是溶酶体里的各种水解酶释放到组织内，使构成组织结构的主要成份如蛋白质、核酸等迅速降解。为了降低酶的活性，要求在0～4℃的低温条件下操作，所用的容器和器械应预冷。

　　(4)避免损伤。在快速取材时，必须做到器械锋利，用锐利的刀片垂直往下切，切时不要拉、锯、压。避免细胞受到损伤。

　　(5)器材保持干净，不可有污染。

　　2.固定时的注意事项

　　(1)戊二醛固定一般为1～2小时，洗涤液多次浸洗时间原则上同固定时间，以免引起细胞雏缩现象。洗涤液尽量采用同系列缓冲液。

　　(2)锇酸作为固定剂，其固定时间不宜超过2小时，如果固定时间过长，会引起一些脂蛋白复合体溶解，甚至会使组织发脆，造成组织切片困难。

　　3.电子染色时的注意事项

　　(1)铀染色液作片染时，最好先将铀染色液进行离心后取其上清液来作铀染色。

　　(2)铅的染色液很容易与空气中CO2结合，形成碳酸铅沉淀，造成标本的污染，所以在染色时，要尽量减少与空气接触，在操作时尽量避免和人呼出的CO2接近，要迅速盖上盖。有的人为了防止铅沉淀污染，在培养皿内放置NaOH丸或0.1N的NaOH湿的滤纸，以吸收空气中的CO2。

　　一般组织切片用铅染色时间为数分钟～10分钟左右。需要注意是，过长的染色时间，不但不会增加反差，却会出现脱色现象。电镜染色很容易过头，过染的结果使反差全部加强了反而使组织结构之间很少有区别了，这样就失掉了染色的意义。