二、过滤

         任何颗粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此，要采取各种预防措施，包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。在HPLC系统中，颗粒物的主要来源有三个途径：流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。

1、流动相

        如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2 µm微孔滤膜过滤。同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2 µm微孔滤膜。然而，如果有任何一种缓冲液中加入了固体物，例如磷酸盐，流动相过滤将是必要的一个步骤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边缘挤压就会产生塑料颗粒。在这种情况下，添加的一种固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒存在于流动相中成为残渣。

        流动相通过0.45 µm微孔滤膜过滤对于从流动相中除去所有颗粒物是一个有效方法。0.2 µm微孔滤膜也可以用，但是它们就这个应用而言并不比0.45µm微孔滤膜更有效，而且它的过滤速度会更慢，特别是当实验室使用的试剂和水的质量不太好时。建议实验室在编写制定他们流动相制备标准操作程序（SOPs）时规定，可以借鉴国际上同类实验室的规定，即：

         流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤，反之所有流动相组成在使用前必须过滤。

        在连接储液瓶和泵的输液管的末端入口采用下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很重要的。这个过滤器的规格为≥10 µm的微孔物质，所以它不能取代流动相过滤步骤，但是它能除去系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的可靠性。

2、被测样品

        液相系统中的第二个颗粒物来源是被测样品。一些实验室在将他们的样品放置在自动进样器盘（或手动进样）以前，所有样品都先通过一个0.45 µm针筒式过滤器过滤。这是一个有效除去被测样品中颗粒物的方法。但是这个过程也有一点需要关注：你使用了针筒式过滤器就不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会有或多或少的丢失。丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。如果有丢失，过滤后液体中被测物的含量或浓度与原基本样液的含量或浓度还相同吗？这个问题一般需要通过实验确认。确认这步是要增加工作量和费用的。过滤器的使用是一种消耗，每个过滤器的价格从几元到十几元。但在做食品中残留物分析时，由于基质大多比较复杂，所以过滤这步已成为不可或缺的一步。在实际分析工作中，一般检测每一组样品会带一个外标、一个添加回收或是质控样品，所以，只要最终检测时得到的信噪比能满足检出限要求，可将这步视为系统误差而忽略。

3、仪器系统部件的磨损物

        最后，在HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。

        第一种建议认为，在一般实验室中输液泵密封垫通常使用寿命为六个月到一年，因此建议半年或一年更换这些密封垫，实验室应基于上述观点制定定期预防性维护计划。该观点认为：与输液泵密封垫颗粒堵塞柱子而更换新柱子的费用相比，更换密封垫的费用低些。一些输液泵有玻璃砂芯或筛网，可在流路中滤掉从泵密封垫磨损下来的颗粒物，防止这些颗粒物随流动相流至柱头。若有这种装置应查阅输液泵操作手册，查看推荐的这种过滤器清洗或更换的间隔。

       另一种建议则认为，原装密封垫的密封效果最好，更换以后容易引起流动相渗漏。所以，只要不漏液就不要轻易更换密封垫。

      两种说法都有其道理，具体如何操作，建议与仪器公司工程师沟通，各公司的仪器还是有些不同的。

     自动进样器旋转轴的密封随着使用时间也会磨损，但是在我的经验中，即便是高负荷的运转旋转轴密封垫也可以使用几年。如果你的自动进样器系统有计数进样阀转动次数的功能，你可以设定一个警铃当预设阀转动次数已达到时提醒你。曾有一种说法，进样器最多转动20,000次，这仅仅是进样10000个；但这似乎不是实验室涉及的常规样品分析使用寿命，它们的实际使用寿命会更长。旋转轴密封磨损后会渗液，比较明显的特征是同一样品多次进样后，峰面积值差别比较大（RSD>5%）。当然，输液泵的密封垫和旋转轴的密封垫磨损将增加更多研磨物在流动相中，加速对这些部件的损伤。此外，如果你日常运行的流动相有缓冲盐，如磷酸缓冲盐，密封垫的磨损会更快。

 

       无论颗粒物源于何物，实验时都要将其除去。推荐在HPLC系统中采用一个0.45或0.5 µm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如采用一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又方便（几分钟就可更换）。若采用在线过滤，HPLC系统检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升一定值，例如25%或增加500psi，应该更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。

高效液相色谱仪操作步骤（原文摘录自网络）：

1）过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2）对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3）打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4） 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。 冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6）调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7）设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8）进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9）关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10）填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1）流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2）柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3）所有过柱子的液体均需严格的过滤。

 ）压力不能太大，最好不要超过2000 psi。

        高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC也已成为不可或缺的分析仪器。和其它分析仪器一样，你若想让HPLC很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，最重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。

一、脱气

      流动相脱气对于避免HPLC系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC系统内是不希望有气泡存在的。HPLC泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。

       当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。

       紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。

       所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE管）渗透进流动相中。

       如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种：

1. 吹氦脱气法。利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa压力下，以约60 mL/min流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。

2. 加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。

3. 抽真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。

4. 超声波脱气法。将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中，用超声波震荡10～20min。此法的脱气效果最差。

5. 在线脱气法。现在商品的HPLC仪器，均可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。建议购买仪器时一定要购买，有的公司是作为选购件，所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。

 

高效液相色谱仪操作三要点（中）

高效液相色谱仪操作三要点（下）

亲和色谱法 affinity chromatography

离子交换色谱法 ion exchange chromatography，IEC

离子色谱法 ion chromatography

离子抑制色谱法 ion suppression chromatography

离子对色谱法 ion pair chromatography

疏水作用色谱法 hydrophobic interaction chromatography

制备液相色谱法 preparative liquid chromatography

平面色谱法 planar chromatography

纸色谱法 paper chromatography

薄层色谱法 thin layer chromatography，TLC

高效薄层色谱法 high performance thin layer chromatography，HPTLC

浸渍薄层色谱法 impregnated thin layer chromatography

凝胶薄层色谱法 gel thin layer chromatography

离子交换薄层色谱法 ion exchange thin layer chromatography

制备薄层色谱法 preparative thin layer chromatography

薄层棒色谱法 thin layer rod chromatography

液相色谱仪 liquid chromatograph

制备液相色谱仪 preparative liquid chromatograph

凝胶渗透色谱仪 gel permeation chromatograph

涂布器 spreader

点样器 sample applicator

色谱柱 chromatographic column

棒状色谱柱 monolith column monolith column

微粒柱 microparticle column

填充毛细管柱 packed capillary column

空心柱 open tubular column

微径柱 microbore column

混合柱 mixed column

组合柱 coupled column

预柱 precolumn

保护柱 guard column

预饱和柱 presaturation column

浓缩柱 concentrating column

抑制柱 suppression column

薄层板 thin layer plate

浓缩区薄层板 concentrating thin layer plate

荧光薄层板 fluorescence thin layer plate

反相薄层板 reversed phase thin layer plate

梯度薄层板 gradient thin layer plate

烧结板 sintered plate

展开室 development chamber

往复泵 reciprocating pump

注射泵 syringe pump

气动泵 pneumatic pump

蠕动泵 peristaltic pump

检测器 detector

微分检测器 differential detector

积分检测器 integral detector

总体性能检测器 bulk property detector

溶质性能检测器 solute property detector

(示差)折光率检测器 [differential] refractive index detector

荧光检测器 fluorescence detector

紫外可见光检测器 ultraviolet visible detector

电化学检测器 electrochemical detector

蒸发(激光)光散射检测器 [laser] light scattering detector

光密度计 densitometer

薄层扫描仪 thin layer scanner

柱后反应器 post-column reactor

体积标记器 volume marker

记录器 recorder

积分仪 integrator

馏分收集器 fraction collector

工作站 work station

固定相 stationary phase

固定液 stationary liquid

载体 support

柱填充剂 column packing

化学键合相填充剂 chemically bonded phase packing

薄壳型填充剂 pellicular packing

多孔型填充剂 porous packing

吸附剂 adsorbent

离子交换剂 ion exchanger

基体 matrix

载板 support plate

粘合剂 binder

流动相 mobile phase

洗脱(淋洗)剂 eluant，eluent

展开剂 developer

等水容剂 isohydric solvent

改性剂 modifier

显色剂 color [developing] agent

死时间 t0，dead time

保留时间 tR，retention time

调整保留时间 t'R，adjusted retention time

死体积 V0，dead volume

保留体积 vR，retention volume

调整保留体积 v'R，adjusted retention volume

柱外体积 Vext，extra-column volune

粒间体积 V0，interstitial volume

(多孔填充剂的)孔体积 VP，pore volume of porous packing

液相总体积 Vtol，total liquid volume

洗脱体积 ve，elution volume

流体力学体积 vh，hydrodynamic volume

相对保留值 ri.s，relative retention value

分离因子 α，separation factor

流动相迁移距离 dm，mobile phase migration distance

流动相前沿 mobile phase front

溶质迁移距离 ds，solute migration distance

比移值 Rf，Rf value

高比移值 hRf，high Rf value

相对比移值 Ri.s，relative Rf value

保留常数值 Rm，Rm value

板效能 plate efficiency

折合板高 hr，reduced plate height

分离度 R，resolution

液相载荷量 liquid phase loading

离子交换容量 ion exchange capacity

负载容量 loading capacity

渗透极限 permeability limit

排除极限 Vh，max，exclusion limit

拖尾因子 T，tailing factor

柱外效应 extra-column effect

管壁效应 wall effect

间隔臂效应 spacer arm effect

边缘效应 edge effect

斑点定位法 localization of spot

放射自显影法 autoradiography

原位定量 in situ quantitation

生物自显影法 bioautography

归一法 normalization method

内标法 internal standard method

外标法 external standard method

叠加法 addition method

普适校准(曲线、函数) calibration function or curve [function]

谱带扩展(加宽) band broadening

(分离作用的)校准函数或校准曲线 universal calibration function or curve [of separation]

加宽校正 broadening correction

加宽校正因子 broadening correction factor

溶剂强度参数 ε0，solvent strength parameter

洗脱序列 eluotropic series

洗脱(淋洗) elution

等度洗脱 gradient elution

梯度洗脱 gradient elution

(再)循环洗脱 recycling elution

线性溶剂强度洗脱 linear solvent strength gradient

程序溶剂 programmed solvent

程序压力 programmed pressure

程序流速 programmed flow

展开 development

上行展开 ascending development

下行展开 descending development

双向展开 two dimensional development

环形展开 circular development

离心展开 centrifugal development

向心展开 centripetal development

径向展开 radial development

多次展开 multiple development

分步展开 stepwise development

连续展开 continuous development

梯度展开 gradient development

匀浆填充 slurry packing

停流进样 stop-flow injection

阀进样 valve injection

柱上富集 on-column enrichment

流出液 eluate

柱上检测 on-column detection

柱寿命 column life

柱流失 column bleeding

显谱 visualization

活化 activation

反冲 back flushing

脱气 degassing

沟流 channeling

过载 overloading

气相色谱仪是实验室主要的分析仪器之一，与我们的日常工作和分析息息相关，但是关于仪器的使用国达公司总结了十一条黄金建议，对气相色谱仪仪器的保护和分析结果都有一定的帮助。

1、按仪器说明书的规程操作

验收仪器时，不仅要清点所有零部件是否齐全，还要检查仪器说明书是否齐备，并妥善保存这些资料。

2、准备一份色谱柱测试标样。色谱柱性能是保证分析结果的关键。新买的色谱柱，首先要用测试样品评价其性能。

3、使用纯度合乎要求的载气

载气一定要用高纯级的，以避免干扰分析和污染色谱柱或检测器。要知道一根色谱柱的价格是一瓶高纯氮气或氢气价格的20倍以上。

4、及时更换石墨密封垫

石墨密封垫漏气是GC最常见的故障之一。一定不要在不同的柱上重复使用同一密封垫，即使同一根柱卸下重新安装时，最好也要换新密封垫，这样能保证更高的工作效率。

5、定期更换气体净化器填料

变色硅胶可据颜色变化来判断其性能，但分子筛等吸附有机物的净化器就不好用肉眼判断了。所以须定期更换，最好3个月更换一次。

6、使用性能可靠的气体减压器

新的减压器在使用时一定要试漏，在长期的使用过程中也要经常检漏，这是发现问题的一个好习惯。

7、定期更换进样衬垫

进样口衬垫漏气是GC常见故障之一。另外，衬垫的老化降解也会给分析带来干扰。比如其碎屑掉进汽化室内也可能导致鬼峰。

8、及时清洗注射器

保持注射器清洁能避免样品记忆效应的干扰。更换样品时要清洗，用同一样品多次进样时也要用样品本身清洗注射器。

9、定期检查并清洗进样衬管

仪器长期使用后，进样衬管内会有焦油状物质，这是样品中的不挥发成分造成的。此外还会有颗粒状物质积存(隔垫碎屑，样品中的固体物质)这些都会干扰分析的正常进行。

10、更换零部件要逐一进行

修理仪器时，不要一次更换多个部件，那样会造成故障原因的判断失误。应该一次更换一件，经测试后再更换另一件。

11、做好仪器使用和分析记录并定期归档

这是仪器的履历，应逐日记录，包括操作者、分析样品及条件、仪器工作状态等等。

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　　有机氯、有机磷农药化合物品种多,防治对象和应用范围广,是我国目前使用量最大的农药。粮食、蔬菜、水果、饮料、奶制品、茶叶等食品中农药残留及工业污染给人类的生存环境带来了极大的负担，农产品及农药的滥用所造成的食品中毒事件时有发生。为此郑州创宇科技有限公司应用研究所采用气相色谱仪，建立了有机氯类、农药残留的气相色谱(GC)分离、电子捕获检测器(ECD)测定，以及有机磷农药残留的GC分离、火焰光度检测器(FPD)测定方法。提出了用双进样口、双检测器、双分离柱在一台气相色谱仪实现多种有机氯、有机磷等农药残留组分测定的方法，缩短了分析时间，降低了相关实验室应用该方法时的硬件成本。