来源：仪器信息网
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An internal standard should be used when performing MS quantitation. An appropriate internal standard will control for extraction, HPLC injection and ionization variability. In a complex matrix it is not uncommon for two different standard levels in SRM integrated plots, at the lower end of the standard curve, to give nearly an identical response. It is only when an internal standard is used that the two points can be differentiated. Some researchers attempt to prepare standard curves and run samples without an internal standard and find moderate success. Often without an internal standard % RSDs of replicates can be as high as 20%. Using an internal standard the % RSDs can be brought down to approximately 2%. We run triplicates at each level of our standard curve.

How do I choose an internal standard?

The best internal standard is an isotopically labeled version of the molecule you want to quantify. An isotopically labeled internal standard will have a similar extraction recovery, ionization response in ESI mass spectrometry, and a similar chromatographic retention time. If you are performing non-clinical PK quantitation it may be difficult to justify such a standard since a special synthesis of an isotopically labeled standard can be expensive and time consuming. Often if you are working with medicinal chemists they will have a library of compound analogs that can be used as internal standards. These analogs were made in the evolution of the compound to be tested and will be similar to the compound to be quantified and more importantly will be slightly different by parent mass. Try to avoid using de-methylated (-14) or hydroxylated (+16) analogs as internal standards since these are the most common mass shifts observed in naturally occuring metabolites of the parent compound. A common internal standard is a chlorinated version of the parent molecule. A chlorinated version of the parent molecule will commonly have a similar chromatographic retention time which is an important characteristic of an internal standard. We have found that one of the most important characteristics of an internal standard is that it co-elutes with the compound to be quantified.

How do I use an internal standard? 

First of all an internal standard should be added at the beginning of the sample work-up, typically before the plasma crash or solid phase extraction. The internal standard should be added at the same level in every sample including the standards. An internal standard should give a reliable MS response. Care should be taken that the amount of the internal standard is well above the limit of quantitation but not so high as to suppress the ionization of the analyte. "How much internal standard should I add?", this is an important question. It pays to know roughly how much compound is in your sample. This can be accomplished by making trial analyses of an early, middle and late time point with perhaps one or two standard points. This information will be very valuable when building an appropriate standard curve and in knowing how much internal standard to add. If you were trying to quantify samples in the range of 100 fg to 25 pg and the limit of detection was 100 fg you might add 5 to 10 pg of internal standard to every sample. A good rule of thumb is to target the internal standard to the lower 1/3 of the working standard curve. This is a range that will give a comfortable response without interfering with the ionization of the analyte.

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中文：

什么叫内标法?怎样选择内标物?

内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。

内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。

在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?

影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。

由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。

化学方面的因素包括：
1、内标物在样品里混合不好；
2、内标物和样品组分之间发生反应，
3、内标物纯度可变等。

对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，

在制作内标标准曲线时应注意什么?

在用内标法做色谱定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。 

外标法

用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。

外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：

　　　　　W＝A(W)／(A)　　　　　　

式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。　

外标法 external standard method 色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。

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定量分析中怎样选择内标法或外标法

选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。

内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 选择内标物有4个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。 内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。 外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。

内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。

1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析，没有自动进样器，用外标法定量，确实重现性与稳定性非常差，结果经常受到搞合成同事的质疑。其实，仔细分析原因不一定就是外标法不适合这种定量分析，首先我们的实验室仪器和手段是否调整到一种稳定而合理的状态了，比如，衬管是否洁净，玻璃棉的位置是否合适恰当（能否使样品尽可能的汽化）、汽化温度是否合适、色谱峰形是否对称（也就是样品与色谱柱健合相是否匹配）、附近有没有其它色谱峰的干扰、选用什么进样方式（如快速进样还是热针进样）等等因素的影响都需要考虑，如果这些因素都考虑了，按照GMP方法验证对于精密度的要求，同一样品进6针以上的RSD和配制6个样品的定量结果RSD都能满足小于1.5%的要求，那么这个方法用外标法就是完全适用的，但是前面的影响因素是一定要都考虑到的，否则谈论这个方法是否适用就有失偏颇了。在做过的许多出口产品的定量分析方法当中有许多是一些医药公司提供的比较完善而验证过的方法，内标与外标都有（他们用的都是自动进样）精密度都能满足RSD小于1.5%的要求，当一个方法能够满足测试要求的时候，无论内标外标，都是可行的，当然有一个分析成本和分析时间的问题，内标的成本和控制溶液、样品溶液的配制当然要比外标要高和麻烦一些了。而有些时候，可能受你实验室现有仪器和附属设备的影响，达不到一定的要求，而还必须进行定量分析，有时外标的结果可能就要差一些，这时，你可能就要考虑用内标法了，可以排除手动进样的误差、分流歧视的影响、包括一些未知因素平行误差的影响，这时内标可能就显示出它的优势来了。

2、上面已经提到当做方法验证的时候，当同一样品配制6个样品溶液用所选用的外标法进行定量的时候，RSD都满足1.5%的要求时，也分为两种情况，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的结果小于1%，那这个方法就没有什么可以怀疑的了；如果RSD的结果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时，这个方法的可行性就将受到质疑，毕竟这是方法验证，你就要考虑上面1所提到的影响因素的影响了，如果排除掉以上的影响因素，RSD还是在1.5%附近，就要尝试内标了，如果内标结果的RSD很好，就证明你的这个方法受实验条件的影响很大，只能用内标了，或者干脆将原方法做大的变动，再尝试用外标法测试。

3、而对于微量分析，比如农药和兽药残留的分析、环境分析等，根据不同的限量标准要求对于精密度的要求也比常量分析的要求要宽松的多，RSD有时可以允许达到10%甚至更高，这时可能外标法有更大的应用空间。

4、单从精密度方面去考虑，排除其它成本和效率的因素，个人认为还是内标优于外标。曾经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺为内标，RTX-5 amine（碱改性） 15m*0.32mm*1.0um色谱柱分析，将配制好的控制溶液（含有内标物）自动进样器进6针，目的物（二氨基丙醇）与内标物（二乙醇胺）峰面积比率的RSD为0.18%，而只对这六针样品的目的物峰（二氨基丙醇）面积求RSD，结果为0.71%，通过这一实例的结果大家就会发现到底哪个方法精密度更好了，当然是内标更好了。当然这个化合物的检测方法最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以的，实验室可以自由选择。但内标与外标精密度结果的差异是显然存在的事实。

结论：应用外标法能够满足要求，首选还是外标法了，毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下，用内标法还是必要的。无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要的，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。

外标法
用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。
注入色谱柱的到其响应值（峰面积）。
在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。
在完全相同的实验条件下，注入未知样品，得到欲测组分的响应值。
根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。

外标法的优点：
操作、计算简单，是一种常用的定量方法。
无需各组分都被检出、洗脱。
需要标样。
标样及未知样品的测定条件要一致。
进样体积要准确。

内标法操作：
将已知量的内标样加入标准样品，制成混合标样，并配制一系列的已知浓度的工作标样。混合标样中标样与内标样的摩尔比不变。
注入色谱柱，以（标样峰面积/内标样峰面积）为响应值。
根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，即W=f×A，制成标准曲线。
将已知量的内标样加入未知样品，注入色谱柱，得到欲测组分的响应值。
根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。

内标法的特点：
操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱的，因此只要混合溶液中被测组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。
内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响，因此比外标法精确。

中国人比较理解四极杆质谱，空间的嘛，离子从哪里产生，从哪里进，从哪里出，一看就明白。

所以，常常推而论之，对于离子阱质谱，大家常常用四极杆的一些评价标准衡量。比如，我们这里说的扫描速度。

这里，要谈的一个问题就是：离子阱采集谱图的快慢，不由扫描速度决定。

离子阱的一个scan cycle的时间（即我们通常理解的获得一张质谱图的时间，在离子流色谱图上，即意味着采集一个点的时间），是由以下几点因素决定的。

1-AGC 预扫描时间（大约为几十个毫秒，在Thermo的离子阱中，使用AGC技术，主要为了自动地预估阱内离

子数多少，控制离子进入阱的那个“门”的大小，从而防止离子在离子阱中过载，因为过载后会引起空间电荷效应，带来谱图和线性的扭曲）

在Bruker和Agilent的离子阱中，使用ICC技术，是直接在离子注入离子阱的时候，一边注入，一边通过内插算法调节离子门大小，所以没有这个时间。


2-离子“注入”的时间（Inject time，这个时间是最长的，因此是速率决定步骤）

3-母离子分离和做MSn所需要的母离子激发的时间

4-把子离子依次扫描出离子阱的时间（这个时间由扫描速度决定，我们平时说的扫描速度在这里体现，即把离子从质量分析器逐出的速度）

完成一次scan cycle的真实情况见下图示意。



注：T＝Thermo；Ag＝Agilent；Br＝Bruker
AB的线性阱，具体参数不了解，但应该注入时间也大大减小。

通过以上分析，我们可以得知：不管是什么样的离子阱，只要速率决定步骤（即离子“注入”的时间）没有得到很大提高，扫描速度快慢与否，跟实际采集一个峰的点数关系并不大。这就好比开车从家到单位，从家到上高速前要堵40分钟，上了高速跑5分钟，下来再堵10分钟到单位。在高速上，即使开车速度提高1倍，对于整个行程时间的贡献也很小。瓶颈在从家到单位啊。

新型仪器二维线性阱之所以好，是因为“注入”时间Injection time，即决定速率的步骤，比所有的三维离子阱快很多，所以整个Scan Cycle的时间<200ms，跨越一个10 sec的色谱峰，可完成 > 50次的扫描。

　　去年曾根据多年在实验室从事食品分析工作的经验写了一篇博客“食 品 检 测 实 验 室 仪 器 设 备 的 配 置”。有网友提出建议，希望对仪器设备的特性、配置、选型再做一些介绍。现就食品检测实验室选购气相色谱-质谱(GC-MS)时应考虑的问题做进一步的详述。也算是给初建实验室及使用者的一些提示和建议。由于本人的学识和工作内容都很有限，肯定有很多东西谈的不够准确或不全面，还希望各位同仁给予指正和补充。在这里先谢谢了!

　　现在绝大多数食品检测实验室均是配置色-质联用仪，单独使用质谱仪检测的已经非常少了。唯一单独使用的是应用同位素质谱仪检测蜂蜜等食品中的同位素比，以确定产品是否掺伪。本文主要介绍一下GC-MS购置时需要考虑的主要性能及功能。

      GC-MS是高分离功能的GC与能提供被测物质分子信息的MS联用分析仪器。两种仪器功能互补，使仪器的分析功能更强大。例如：质谱能提供被测物的特定分子信息，对化合物的定性更加准确。但是，质谱无法区分同分异构体，而色谱分离同分异构体很容易。所以，色-质联用仪的功能是1+1>2。

　　现在GC-MS的GC部分均采用高分离性能的毛细管色谱，可以选配不同类型的进样口，如：最常用的分流/不分流进样口和(温度/压力)可编程控制进样口。柱箱多级程序升温控制。在谈到气质联用性能时，现在国内市场上比较常见品牌的主流型号GC的性能、功能并无多大差异。故在GC方面不再做比较。

　　MS的类型有多种，通常是按照分析器的类型来分，有四极杆质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱、四极杆串联质谱、高分辨磁质谱等。不同厂家的不同型号的MS性能、功能、价格或者说性价比都存在较大差异。所以，本文将主要围绕MS进行论述。目前食品检测实验室配置使用的GC-MS联用仪多配置低分辨MS，这类仪器以目标化合物的定性、定量为主，兼有一定的未知物定性功能。选用这类仪器有两个目的：

　　第一， 也是主要目的，是对食品中残留物进行分析。

      既然是用于残留物分析，仪器的灵敏度至关重要，也是选仪器时首先应考虑的。但这不是唯一的指标(特别是不能仅看标称指标)，还要综合考虑仪器的分辨率、质量稳定性、质量范围、动态线性范围、抗污染能力(包括仪器离子源、预四极等部件的清洗维护是否方便)、以及软件操作是否方便等。

　　GC-MS在残留物的分析中应用愈来愈普遍，是因为MS是一个通用型检测器，对大多数有机化合物都有比较好的响应。另一方面，四极杆质谱检测时有一个选择离子方式(SIM方式)，与全扫描方式相比可以提高检测灵敏度2、3个数量级，检测灵敏度较氢火焰检测器(FID)、火焰光度检测器(FPD)、氮磷检测器(NPD)高，稍逊于电子俘获检测器(ECD)对有机多卤素化合物的检测。残留物分析多为目标物检测，所以，用SIM方式检测既有广谱性(对化合物的响应而言)，又有特异性(对不同化合物各自的特征离子而言)，因而特别适合用于多种残留物的检测，提高分析效率。

　　现在仪器公司买仪器时所列出的技术指标有：灵敏度、分辨率、质量稳定性、质量范围、动态线性范围等。

市场上厂家标称的灵敏度为什么这么高？

　　现在表述灵敏度是用八氟萘(OFN)，如：EI+，1pg OFN信/噪(S/N)>100。现在的信/噪比是RMS(均方根)方式，数值上与过去的灵敏度值相比高了很多。过去信/噪比是峰-峰比，即：信号的峰高/基线噪音的峰高，比较一目了然，自己拿尺子量都能量出来。但据厂家说，在选择基线噪音时有人为误差。现在厂家将信/噪比编成固定的程序，比如信号值与固定时间段（如1~2min，其实这段时间的基线是比较平的）噪音的比值。但现在的测定方式厂家其实同样有很多偷手，比如测试时用厂家自带的短测试柱(10m或15m)，质量的扫描范围减少，进样量增加(过去是空气-样液-空气绝对1μL，而现在1μL是包括针头死体积)。没办法，现在厂家为了竞争都这样做，用户也只好跟着走。所以，现在仅看厂家的标称指标是不够的。

做灵敏度指标时应该注意哪些问题？

      做灵敏度指标时应该注意几个问题：

（1）应该先做分辨率，在保证单位质量分辨时，再做灵敏度。如下图所示，可以采用一种近似方法，即，半峰高处的峰宽不小于1/2峰宽(此图转载自www.antpedia.com网dingdang的“谈谈有机质谱的分辨率”一文。在此表示感谢。)。灵敏度与分辨率成反比，若为了灵敏度而损失分辨率，会降低了质谱定性功能。

（2）质量扫描范围也应有规定，比如：OFN，200-300amu，扫描范围减小也能提高信/噪比。这些限制性条件应在谈合同时就确定下来。

（3）检测电压应该是正常检测时的工作电压，不同型号的质谱仪因参数表示的含义有差异，所以，各家仪器推荐使用的检测电压值也不同。但是，做灵敏度测试时的电压不应高于推荐正常使用时的工作电压。否则在实际工作时就会有问题，因为实际样品检测时是有基质干扰的，高电压不能提高信/比，而且还会使电子倍增器寿命降低。

       现在国内出现了一些过分强调，或者说厂家过分宣传自己仪器灵敏度高的现象，导致现在标称的灵敏度越来越高，听说RMS信/噪比都有给出1000的了。其实做标准品的指标只是个参考，将来做基质复杂的实际样品(如动物内脏)能得到好的、稳定的结果才是关键。现在有仪器的单位越来越多了，可以在购仪器前做一个实际样品到各家仪器上实测一下，并且了解一下各种仪器用户的反应，这比仅仅比指标更好。

　　仪器的其它指标一般不会有太大问题。

      对于低分辨质谱，分辨率达到单位分辨一般没有问题。

      质量范围现在多标称为2~1025(或1500)u，这个质量范围对于GC-MS够用了。因为，GC-MS分析物是挥发或半挥发物质，分子量一般不会太大。唯一要注意的是若做污染物十溴联苯(MW 954)和十溴联苯醚(MW 970)检测，不能选质量数小于1025u的(个别厂家的MS质量范围最高只有800u)。

      质量的稳定性一般在0.1amu/8hr，这个指标其实也挺重要的。好的仪器几个月校正一次质量数即可，差的每周都要校正。虽不影响检测，但增加操作者的工作量。

      线性范围大于10e4，对残留分析够用了。这些指标验收仪器时均需要按照合同的规定认真做。

　　此外，仪器的一些功能在验收仪器时也一定要都亲手做一遍，比如：化学电离源(CI)的更换、直接进样杆的操作、复合电离切换方式(EI/CI)、复合扫描方式(TIC/SIM)等。许多农药含有卤素和电负性基团，因此有电负性。负化学源(NCI)检测这类物质可以获得较高灵敏度，这是由于NCI的本底较低，检测电负性物质时可以获得更高的信/噪比。对于定性也可以起到补充确证的作用。做NCI时需要通入反应气，所以，要求仪器的真空系统要比较好。现在厂家提供的GC-MS配置是可以选配的，若配NCI就一定要配置大抽率的真空泵，起码大于250L/min，最高配置有2×200L/min。另外，还应考虑更换离子源的方便性，有的型号仪器更换离子源可以不破坏真空。

　　残留分析通常是目标物检测，目标物多为农药、兽药、添加剂、化学污染物等。这里的定性仅仅是对目标物进行确证。对于这种定性可以用两种方法，一是与仪器自带的NIST谱库(2006版提供约14万多张)的质谱图进行比对，二是与对应的标准品的质谱图进行比对。实际检测时后者的比对方法更好、更准确。因为，被测物经过前处理和毛细管柱后，基质的干扰会使被测物质谱图的离子碎片和丰度比与NIST谱库的质谱图(通常是由纯品直接进样得到的)产生偏差。而且，定量时也需要有标准品。

 

　　第二个分析功能是对未知物分析

      这里的未知物并非真正意义上完全未知的物质，若真是那种完全未知的物质仅仅靠MS，特别是低分辨的MS对其准确确证还是很难做到。这里的所谓未知物其实是已被人们认知的物质，该物质的质谱信息已被收录在了NIST谱库中，只是我们检测的物质中不知含有这些物质中的那一种。比如，不同地域的同一种天然产物产品的成分是不太一样的，同为玫瑰精油，国产的和进口的成分组成存在差异，通过MS分析及与NIST谱库比对，就能找出两种精油特征物质是什么，量有多少差异，不同在那里。再如，养鱼塘里的鱼突然死了，搞不清是什么原因，那么就取鱼塘里的水化验一下，水里含有什么物质并不清楚，这时我们就认为水里含有某种未知物。拿到实验室化验，经质谱NIST谱库检索比对，初步认为验出了甲胺磷。为保险起见，再打一针甲胺磷的标准品，结果保留时间、离子的丰度比都一致，最终确定水里含有的甲胺磷是致鱼死亡的原因。这类工作在日常工作中遇到的比较少，其对仪器的要求就是检测得到的质谱图与NIST谱库的尽可能相近，这样得到的结果会更准确些。所以，这种最好选择四极杆质谱、飞行时间质谱或高分辨磁质谱。而离子阱质谱，特别是内源式离子阱质谱得到的谱图与NIST库谱图差异要大些。

 

配置选购质谱类型的一点经验

1）第一套质谱建议选四极杆，有更多经费建议配置一些其它类型的

　　根据前面所述，通常购置第一套GC-MS建议选择四极杆质谱。而第二套质谱选择什么类型的质谱应根据实验室的业务情况好好斟酌一下。根据多年实验室工作的经验，建议配置另一类型的MS，因为其它类型的MS也各有特点，可以起到功能互补的作用。

 

2）离子阱质谱擅长做初筛、结构解析和确证

　　离子阱质谱可以做多级质谱，特别适合用于食品中农药多残留的初筛，由于有MSn(理论上n=10)功能，可以通过第二级甚至第三级质谱较好地排除基质干扰，准确确证。当结果怀疑为阳性时再做进一步定性、定量。欧盟一些实验室都是这样做。离子阱质谱对复杂样品检测的定量重现性不及四极杆质谱，但对化合物结构的解析能力较四极杆质谱强。离子阱质谱分外离子源式和内离子源式，外源式离子阱质谱的价格与四极杆质谱的高配相当，内源式离子阱质谱价格与四极杆质谱的低配相当。

 

3）串联四极杆质谱定量及灵敏度俱佳

　　若经费充足可以考虑配置四极杆串联质谱。这类质谱可以做MS-MS，虽不能像离子阱质谱做MSn，但一般二级MS也基本够用了，因为检测的残留物多为分子量在100~300的小分子化合物。四极杆串联质谱比单四极杆质谱的抗基质干扰能力和定性能力更好，与离子阱质谱相比定量重现性和检测灵敏度更好。不同厂家不同型号四极杆串联质谱的价格差别比较大，低的仅比高配的单四极杆质谱高一些，高的接近2套高配的单四极杆质谱。

 

4）飞行时间质谱擅长做定性和确证

　　与气相联用的飞行时间质谱也分为两种，一种具有高分辨和精确质量数功能，另一种则更强调快速检测能力，常与快速气相色谱联用。对食品检测实验室而言，更推荐前者。高分辨和精确质量数功能对化合物定性更准确，当对检测结果有疑义时，换一种模式进行确证，有助于对结果下定论。价格约合2套中上配置的单四极杆质谱。

 

5）高分辨磁质谱只用于很少的领域

　　高分辨磁质谱一般实验室不会配置，主要用于二噁英、多氯联苯等残留物检测。而且此类仪器的灵敏度也较高，所以，经费充足配置一套，对出具的结果更有信心。一台高分辨质谱可以接2台GC，分析效率、确证的准确性、定量的精确性可同时实现，还是很不错的。价格当然也不菲，至少相当于4套高配的单四极杆质谱。

 

6）GPC-GC-MS值得关注

　　另外，还想介绍一套凝胶色谱-气相色谱-质谱(GPC-GC-MS)联用仪。目前残留分析的趋势之一是多残留分析。进行多残留分析时遇到的一个主要问题就是由于选择的离子多了，因而基质干扰也较严重。为了解决这个问题有两种做法，一是利用仪器功能，如二级质谱功能、高分辨功能等，排除基质干扰;二是在前处理净化上下功夫，尽可能地除去干扰物质。前者在文章前面已提到了。而现在介绍的GPC-GC-MS就是将净化仪器与分析仪器组合成联用仪，经过在线净化去除基质干扰，有多维色谱的概念在里面。这种分析仪器加在线净化装置的仪器组合也是残留分析仪器发展的方向之一。这套仪器价格与高配的单四极杆质谱相当，值得关注。

        高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC也已成为不可或缺的分析仪器。和其它分析仪器一样，你若想让HPLC很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，最重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。

一、脱气

      流动相脱气对于避免HPLC系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC系统内是不希望有气泡存在的。HPLC泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。

       当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。

       紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。

       所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE管）渗透进流动相中。

       如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种：

1. 吹氦脱气法。利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa压力下，以约60 mL/min流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。

2. 加热回流法。此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。

3. 抽真空脱气法。此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。

4. 超声波脱气法。将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中，用超声波震荡10～20min。此法的脱气效果最差。

5. 在线脱气法。现在商品的HPLC仪器，均可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。建议购买仪器时一定要购买，有的公司是作为选购件，所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。

 

高效液相色谱仪操作三要点（中）

高效液相色谱仪操作三要点（下）

HPLC分析是系统的工作，每个环节都很重要；看似简单的环节，反而容易疏忽，引起整个实验的结果偏差，因此养成良好的习惯是很重要的。色谱柱是色谱系统的心脏，液相色谱柱的正确安装与使用，是色谱工作的关键；也是获得正确可靠的实验数据的必经之路。

一·液相色谱柱的安装

1.液相色谱柱的结构：

  a.空柱由柱接头柱管及滤片组装而成

   柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英才外螺纹，另一端是3/16英才的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英才外螺纹与1/4英寸柱管（￠6.35mm）连接，中间放置压环用于密封。3/16英才的内螺纹与1/16英才（￠1.57mm）的连接管连接，之间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用￠1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后在拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上（连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸。

    在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片（或滤网），用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

   b.柱填料：

    液相色谱柱的分离作用是在填料和流动相之间进行的，柱子的分类是根据填料类型而定。

    正相柱：多以硅胶为填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10um的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，—NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

     反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他反相填料还有键合C8，C4，C2，苯基等，其颗粒直径在3-10um之间。

 2.色谱柱的安装

   a.拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型，尺寸，出厂日期以及柱内储存的溶剂。

   b.拧下柱两端的密封堵头放回包装盒备用。

   c.按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口连接（如条件允许，建议在柱前使用保护柱）；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为.57mm、内径为0.1mm-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈，切记不要用力太大。如色谱柱通过流动相加压后有漏夜现象，请用扳手顺时针拧1/4圈，直至不漏夜为止。

二·液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行的柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只要这样测试的结果才有可比性。

1.样品的前处理：

a.最好使用流动相溶解样品。

b.使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c.使用0.45um的过滤膜除去微粒杂质。

 2.流动相的配置：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a.流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。

b.流动相具有一定的惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。

c.流动相的黏度要尽量的小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液压泵的使用寿命（可运行提高温度的方法降低流动相的黏度）。

d.流动相的化学性质要与使用的检测器相适应。如用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e.流动相的沸点不要太低，负责容易产生气泡，导致实验无法进行。

f.在流动相配置好后，一定进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

 3.流动相流速的选择：

   因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6 mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。

   当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

1）.由于甲醇的廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系（必须使用乙腈的除外）。

2）.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的乙烷做流动相，没有提纯的乙烷不的使用。用水最好使用超纯水（电阻率大于18兆欧），去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析的结果。

3）.含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌的生长。

4）.流动相要求使用0.45um滤膜过滤，除去微粒杂质。

5）.使用HPLC级溶剂配置流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

 4.柱性能的测试：

——启动液相色谱仪：

a. 流动相流速设定为1ml/min。

b．UV检测器波长设定为254nm。

——使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。

——记录并计算测试结果。

高效液相色谱仪操作步骤（原文摘录自网络）：

1）过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2）对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3）打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4） 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。 冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6）调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7）设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8）进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9）关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10）填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1）流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2）柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3）所有过柱子的液体均需严格的过滤。

 ）压力不能太大，最好不要超过2000 psi。

·柱温箱温度范围
国厂仪器：常温～400℃；国外仪器：常温～450℃。很多可配低温系统，可到零下100℃

 
·柱温箱的升温速度
指柱温箱在多少时间内能升到300～400℃。

 
·柱温箱的降温速度
指柱温箱在多少时间内能降到常温。

 
·程序升温
用几阶几平台来表示。

 
·柱温箱的温度的稳定性
环境温度的变化对柱温箱温度的影响，单位℃ / ℃。

 
·控温精度
控制温度的精准程度，一般国外气相色谱仪器可达±0.1℃。

 
·温度指示偏差
指温度设定值与显示值之间的误差，一般国外气相色谱仪器可达1%。

 
·压力设定范围
0～n Psi（kpa） （注：Psi是压力单位1 atm = 14.6959 psi =1013250kpa）
一般，取整来简单计算，100 Psi＝150 Kpa。

 
·压力控制精度
压力控制精度，这个在可电子压力流量控制的进口仪器的指标上会标注。

 
·流量设定的范围
指仪器所能设定的最低流量和最高流量。

 
·检测器的灵敏度
通过检测器能检测出一定量的组分时，所给出的信号大小称为该检测器对该组分的灵敏度，也称为响应值或应答值，是衡量检测器质量的重要指标。浓度型检测器（如热导、电子俘获）单位：mV·mL／mg （液体样品）mV．mL／mL（气体样品） 质量型检测器（如火焰离子化）单位：mV·s／g ，灵敏度越大越好。

 
·检测器的噪音
这是检测器所固有的，单位：mv或A。

 
·检测器的检测限
指检测器产生的信号恰是噪声的二倍时，单位体积或单位时间内进入检测器的组分质量，以D 表示。浓度型检测器为mg／ml或 ml／ml；对质量型检测器为：g/s。检测限越小越好。

 
·检测器的飘移
指基线包络对基准位置的偏移，通常用半小时内的最大偏移量来衡量。单位：mv/0.5h 或 A/0.5h 。漂移值越小越好。

 
·检测器的最高使用温度
不同检测器都有一个最高使用温度。

 
·电子气路控制（EPC）
英文全称：electron progress control这个装置能够精确地控制气体流量。

 
·大体积进样
针对所需考虑是否需要配大体积进样装置。

 
·仪器联用
考虑以后可能要联用MS，还要考虑能否能否与MS联用。
 

       近来在“分析百问”栏目中看到有不少提问有关气相色谱毛细管色谱柱的问题。根据一些文献和多年的使用经验，对毛细管柱的性质和使用进行了一个归纳总结。希望能对刚刚接触这一工作的初学者有一点点帮助。

1 简介

        气相色谱毛细管柱因其高分离能力、高灵敏度、高分析速度等独特优点而得到迅速发展。随着弹性石英交联毛细管柱技术的日益成熟和性能的不断完善，已成为分离复杂多组分混合物、及多项目分析的主要手段，在各领域应用中大有取代填充柱的趋势。现在新型气相色谱仪、气相色谱-质谱联用仪基本上都是采用毛细管色谱柱进行分离分析。但是，毛细管色谱柱柱内径较小，固定液的膜薄，用于食品中残留物分析时，若使用不当，色谱柱性能很快就会下降。本文旨在向初次接触气相色谱毛细管柱的操作者介绍不同类型的毛细管色谱柱的性质、选择、使用方法及注意事项等。

       毛细管柱只能安装在配有专用毛细管柱连接装置的气相色谱仪上。现在购买仪器时最常规的配置是配毛细管分流/不分流进样口。

2 毛细管色谱柱的类型

       毛细管色谱柱的类型有很多种，但目前最常用和商品化的，是开口熔融石英交联毛细管色谱柱。本文仅介绍此类毛细管色谱柱的性能特点。

2.1 熔融石英毛细管柱

      2.1.1 熔融石英毛细管柱材料

现在市售商品化的气相色谱用毛细管柱几乎都是由熔融石英制作的,简称石英毛细管柱。制作毛细管柱用的石英纯度非常高，几乎无其它杂质。它具有熔点高（近2000℃）、热膨胀系数低、化学稳定性好和抗张强度高等特点，是制备毛细管柱的理想材料。

毛细管柱内壁存在有许多具有吸附活性的基团，这些基团的存在直接影响固定相涂渍效果，所以，在涂渍固定相之前，柱表面必须经过适当预处理，以期得到较高的柱效和对称的色谱图形。

        2.1.2 石英毛细管柱的聚酰亚胺外涂层

石英毛细管柱很脆，只有在毛细管柱外涂一层聚酰亚胺保护材料后才具有很好的弹性，在使用这样的色谱柱时应十分小心，避免将聚酰亚胺涂层损坏，导致毛细管柱易折断。

通常商品毛细管柱出厂时都固定在一个金属丝制作的柱架上，柱架的直径与毛细管柱的直径成正比，即：毛细管柱的直径越大，固定架的直径也就越大。对于0.53mm内径的毛细管柱，过度弯曲很容易折断，使用安装时要格外小心。

石英毛细管柱外涂层还有采用镀铝膜的，这类柱子适用于高温分析。但日常分析工作中使用较少，这里不作详细介绍。

 

2.2 液体固定相

将固定相均匀涂渍在毛细管柱的内壁，制成壁涂型毛细管柱，这类毛细管柱属非交联型毛细管柱。现在只有少部分的非交联固定相的毛细管柱在使用。非交联毛细管柱的固定相容易流失，不能清洗，因此使用寿命较短，但制作成本较低，涂渍相对较容易，往往在毛细管柱研制前期过程中采用此方法。在使用这类毛细管色谱柱时，应注意使用温度不要超过液体固定相的最高使用温度。建议不要在气相色谱-质谱联用仪上使用。

2.3 交联固定相

现在市售的商品毛细管色谱柱基本上均采用交联技术，将固定相与石英表面结合起来，在毛细管柱表面形成一层不溶的类似橡胶的非常稳固的涂层。被交联的固定相与涂渍的固定相相比，流失低，抗污染，热稳定性好，使用寿命长。

如果交联固定相色谱柱被污染，可以用适合溶剂来清洗（见第5节）而基本不会对涂层造成损伤。而且此类毛细柱在色谱分析时可以通过柱上进样和不分流进样模式实现大体积进样，最多可注入50～250μL液体溶剂。当然，这需要仪器上配有相应的装置。

2.4 最高操作温度

可以通过不同的方法来确定一个特定的毛细管柱的最高操作温度。作为商品化的交联固定相毛细管色谱柱，使用时应注意不要超过说明书或标识牌上规定的最高温度。如超过规定的最高温度，特别是恒定持续的超高温操作，会造成毛细管色谱柱不可逆的损伤，轻则使柱效下降、使用寿命减少，重则使毛细管柱损坏。

对于相同型号毛细管色谱柱而言，固定相涂层薄的比涂层厚的允许使用的最高温度可以稍高一些。

2.5 最低操作温度

色谱柱操作温度的低限是由固定相从液体变为固体的温度所决定的。如果色谱柱在其最低温度以下工作，就可能出现峰展宽并且有些被测物难于分开。

表1中列出各种不同固定相和膜厚的色谱柱推荐使用温度。表中给出的温度值可作为参考值。

表1 不同固定相和膜厚的色谱柱的推荐使用操作温度

固定相	最高操作使用温度℃ a		最低操作温度
	薄膜(<1.0μm)	厚膜(>1.0μm)	℃
100％二甲基聚硅氧烷	320/350	310/330 b	-60
5％二苯基 95％二甲基聚硅氧烷	330/360	310/330	-60
6％腈丙苯基 94％二甲基聚硅氧烷	330/360	310/330	-80
35％二苯基 65％二甲基聚硅氧烷	300/320	260/280	-60
14％腈丙苯基 86％二甲基聚硅氧烷	300/320	240/260	-20
50％苯基 50％甲基聚硅氧烷	300/320	260/280	-20
100％三氟丙甲基聚硅氧烷	320/340	240/260	40
50％腈丙甲基 50％苯甲基聚硅氧烷	220/240	200/220	55
聚乙二醇	250	220/250	55
90％双腈丙基 10％苯腈丙基聚硅氧烷	260/275	­——	20

注：
a. 前面为等温操作最高温度，后面为程序升温操作最高温度。
b. 色谱柱的操作温度应以公司产品说明书规定为准，表中的值仅供参考。

 

继续阅读：

[原创]气相色谱毛细管柱使用知识（二）

[原创]气相色谱毛细管柱使用知识（三）