定量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量PCR仪上实现的呢?下面将进行一一介绍。

利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量：

用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，首先要有一组稳定的标准品。标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳定。一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。

以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完全结束后再进行分析。

点示“Analysis”，弹出分析框，默认分析功能即为“Quantitation”，点击“Show”，软件即自动给出包括标准曲线(包括R值，R平方值，扩增效率、标准曲线公式等)、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度(包括标准偏差、变异系数等)在内的结果。

若是使用SYBR Green I法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。对于SYBR Green I的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。

同样，点击“Analysis”，在分析窗口中选择“Melt”，点击“Show”，自动给出分析结果。

完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击“Analysis”边上的“Report”选项，选择报告模板，软件自动给出报告。

利用定量技术进行基因型分析研究：

常用的分析方法有两种，一种是Taqman探针法，一种为FRET探针法(又称Hyb探针)，运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR仪。Taqman探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而FRET探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。

以下为用Taqman探针判断基因型的实例：

这里，突变型的探针以FAM荧光素标记，野生型的探针以VIC荧光素标记，检测时分别同时检测了FAM通道和VIC通道的荧光情况。这里，3、4号样品只在FAM通道有信号，而在VIC通道里无信号，表明这两个样品为突变型;1、2号样品在FAM通道无信号，在VIC通道有信号，表明这两个样品为野生型;而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。

并且，我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型，软件会根据不同样品在各个通道的荧光情况，自动对各个样品的基因型做出判定。

以下为用FRET方法分析基因型的实例：

如上图，荧光探针与突变型完全匹配，而与野生型存在一个碱基的错配，因而打开这两组双链所需的能量就不同，具体体现在熔解温度的差异上，因而突变型的样本有较高的熔解温度，而野生型的样品熔解温度相对较低。在图中，5号样本熔解温度较低，为野生型;2号样本熔解温度较高，为突变型;而1、3、4号样品在高温和低温处都出现了熔解峰，则它们为杂合型。并且用户还可以将不同的峰定义为不同的基因型，软件可根据用户的定义自动给出未知样品的基因型。如上图表格中所示。

利用相对定量的方法分析目的基因的上下调情况：

基因表达调控研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt法和双标准曲线法。由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。我们分别来看看以上两种相对定量分析方法的特点和应用。

Delta-deltaCt：

公式：

由Delta-delta Ct的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致。

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用：

1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。

2. 每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。

用Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。

下面是某科研用户用Delta-delta Ct进行相对定量分析的实例：

首先，该客户分别做了目的基因和看家基因的确标准曲线，根据软件自动给出的M值判断该方法的可行性：

如下图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因(Gene of Interest)和看家基因(Housekeeper Gene)做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的差值<0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量。

确定这两个基因可以用Delta-delta Ct法分析后，用户扩增了其待测样品的目的基因和看家基因。经软件自动分析后，给出分析结果，如下：

我们看到，在该客户的实验中，以样品A为对照组，软件自动组出了样品B和C的目的基因相对于样品A的表达情况。 这种方法对于样品量大，但研究的基因数目相对较少的客户特别有用，因为一旦条件优化好之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。

双标准曲线法：

公式：

双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。

双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用：

1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。

2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。

并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。

每种相对定量方法都会有一定的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta Ct法更为简单。

下面是某科研用户用双标准曲线法进行相对定量分析的实例。

要用该方法进行分析，客户在一轮反应中，对目的基因和看家基因分别做了一组标准曲线，同时也分别扩增的待测样品的目的基因和看家基因。

如下图，选择软件中相应的分析方法。

软件自动给出分析结果：

同样，结果自动给出了待测样品相对于对照组目的基因的表达情况。

比较定量法：

另一种相对定量分析方法叫比较定量法(ComparativeQuantitation)，该方法在结果验证中的应用相对较多。

比较定量法的特点、注意事项及实际应用：

1.必需确定起始样品的总核酸浓度一致。在验证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致的核酸样品。

2.作为常规的基因表达调控研究，建议研究者使用前两种定量方法。

3.该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比较，重复性更好。

4.该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。使用时，样品均定义为unknown，分析时选用ComparativeQuantitation，确定对照组，完成分析。

应用实例：

用Comparative Quantitation法进行定量分析时，在保证起始总核酸量一致的前提下，只要对目的基因进行扩增即可，例：待测样品A、B、C，扩增目的基因。在软件中选择相应方法，即得以下结果：

上图左下方即相对表达量的结果，其中Rep.Conc为样品B、C相对于对照组A的目的基因浓度。右侧，可通过修改Calibrator Replicate改变对照组，以获得不同的比较结果。

荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有 8 年了，但是其应用在近四年才迅猛增长。在 Medline 数据庫中，用“ Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索，在1996 年仅有 19 篇，在 1997 年仅有 28 篇，在 98 、 99 、2000 年分别达到了 52 、 157 、 409 篇， 2003 年已经达到2984 篇，相信在不久的将来会有更多的文章发表。针对实时 PCR 这一热点领域，闪晶公司对它进行了深入细致的研究，并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。

荧光定量PCR基本原理

•  Taqman 技术：该技术以美国 ABI 公司为代表。 PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， PCR 仪检测不到荧光信号； PCR 扩增时（在延伸阶段）， Taq 酶的 5'' － 3'' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。

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•  Beacon 技术：该技术以美国人 Tagyi 为代表。也是加入了荧光探针，但它是 环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成， 两端分别标记 荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在 PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

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•  FRET 技术：该技术以 Roche 罗氏公司 为代表。它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的 3 ‘端标记荧光激发基团，另一条的 5 '' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在 PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。

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实时荧光定量PCR中的几个俗语

•  Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。（如图所示）

•  荧光域值（ threshold ）：是指 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即： threshold

•  Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔 1 〕，起始拷贝数越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

 

荧光定量PCR应用广泛

•  可以对各种基因的表达进行定量分析，如：同一基因在不同组织中的表达差异、同一基因在不同药物处理后的表达差异、转基因食品的检测。过去最常用的高通量筛选基因表达差异的技术是 cDNA 芯片和差异显示，但这两种技术的缺点是只能定性而非完整意义上的定量分析。实时 PCR 技术和高通道实时 PCR 仪的出现，无疑为这种检测提供了极大的方便。

•  可以进行点突变分析和等位基因分析，用不同的荧光报告基团标记 Taqman 探针，然后分别与野生型和突变型杂交，如果一种荧光信号明显强于另一种荧光信号，则表明它是纯合子；如果两种荧光信号都明显增强，则表明它是杂合子。另外分子信标（ Molecular Beacon ）就是专门为这种技术设计的探针。

•  可以进行单核苷酸多态性的分析，检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

•  可以进行 DNA 甲基化检测， DNA 甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight 的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。

•  对传染性疾病进行定量定性分析，这在我国应用比较广泛，大家比较熟悉。许多生产临床 PCR 试剂的厂商已经陆续推出了一系列的诊断试剂，如：肝炎系列、性病系列、肿瘤系列等等。

荧光定量PCR操作程序

1. 根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。

2. 提取 DNA/ RNA 。

3. Real Time PCR荧光定量PCR，进行实验结果分析

4. 实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料

MicroRNAmiRNA荧光定量PCR技术服务

一、什么是miRNA?
MicroRNAs miRNAs是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRN As 。

二、miRNA是如何产生的？

ri图一： Micro RNA 的产生

miRNAs 是转录后长片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在细胞核内被双链 RNA 特异的核酸酶Drosha 处理成为 70-100 个核苷酸组成的发夹结构 RNA （ pre-miRNA ）。这一发夹结构 RNA 运输到细胞质，被另一个双链 RNA 特异的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 个 核苷酸组成的成熟的 miRNA ，结合在与 RNA 介导的沉默复合物（ RISC ）类似或者相同的复合物中，这个复合物参与了 RNA 干扰。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的碱基配对引导 RISC 降解目的片段或是阻碍其翻译过程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互补的碱基配对决定了这个过程的特异性。通过抑制翻译还是降解发挥作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之间的错配程度决定的，匹配程度高的目的 mRNA 将被降解。由于 miRNAs 可以对不完全互补的 mRNA 配对来抑制蛋白质的翻译过程，因而每个 miRNA 可以有多个靶基因，而几个 miRNAs 可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个 miRNA 来经济地调控多个基因的表达，也可以通过几个 miRNAs 的组合来精细调控某个基因的表达。对于基于 miRNA 调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。

三、miRNA荧光定量PCR基本原理
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25个核苷酸组成的小RNA，长度太短，并不能通过传统的实时定量PCR进行检测,但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。

图一 miRNA 实时荧光定量PCR原理

虽然 microRNA 实时定量PCR是一种最近才发展起来的检测技术，其技术细节还在不断完善中,但是microRNA 实时定量PCR检测系统，相对其它microRNA检测技术有以下优点：

1.高特异性 , 可以只对成熟 microRNA 进行定量，有效区分成熟 microRNA 分子和前体分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子；

2.快速，简单，省时，整个操作只需两步，不到 3 个小时，即可获得高质量的数据；

3.检测灵敏度高，样品消耗少，仅需 1-10ng 的总 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ；

4.超宽的线性范围，可跨越 7 个数量级；

图二 人的脑（ B ），心脏（ H ）和肝脏（ R ）组织中 microRNA 表达情况：分别采用实时定量 PCR ，终点法 PCR 和 Northern Blot 检测， RNA 用量和时间见图。

四、miRNA序列在线查找

http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/

 

 

Q1．无CT值（信号）出现
A1．1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

Q2．CT值出现过晚
A2.1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。

Q3．标准曲线的线性关系不佳
A3.1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针
4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高

Q4．阴性对照也出现明显的起飞
A4．1.应mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。

Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程
A5．如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。

Q6．熔解曲线不止一个主峰
A6．1．引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
4.模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

Q7．扩增效率低
A7．1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2.反应条件不够优化，可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3.反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

Q8．实验重复性不好
A8．1.加样不准确。
2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。
3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。

Q9．变性温度是否合适
A9．大部分的双链DNA在95°C就开始解链了，在有些情况下在90至94°C都不能很好地变性DNA。由于部分变性，参加反应的探针和引物相应的减少了，因此反应效率会下降。

Q10．变性时间是否合适
A10．15到20秒对于变性扩增子是足够了，然而，长一点的产物，可能会需要30秒，60秒的变性时间通常是不需要的。

Q11．退火温度和时间是否合适
A11．检查引物和探针的Tm值，SYBRGreenI的退火时间大约20到35秒，双标记探针通常是两步法，退火和延伸合并为一步，时间大约是45到60秒，温度通常在60°C，对于FRET探针退火步骤大约20到30秒。

Q12．在哪一步骤采集信号
A12．SYBRGreenI应当在72°C，此时绝大部分的DNA是双链状态，如上所述，双标记探针通常是两步检测，因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。对于FRET检测，数据应该在退火步骤检测。如果对于信号采集点不确定，可以多点采集作对比。如果监控屏幕检测不到信号，检查程序设定是否存在至少一个的信号采集点。

Q13．是否选定了合适的增益值
A13．一些情况下会看到曲线超过了窗口范围，在荧光强度100的地方成一直线。尽管大部分的数据可以用，但是减少增益，一些原始数据就不会超出范围。有时，在第一个循环信号就跳出了窗口范围，这是由于增益选得太高，看起来像没有检测到数据。如果熔解曲线分析时，开始荧光就达到了100，则应当用低的增益重新运行，而不需要重新运行扩增反应，SYBRGreenI和FRET的样品可以在一定程度上反复使用