蛋白质分离纯化一条街：凝胶过滤层析

凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC）又称

尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）

凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography，GPC）

分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography，MSC）

注：在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液；在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂；在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析；本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析（GFC）表示。

（1）分离机理

GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。

蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短；较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长；基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。

注1：球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。

（2）应用范围

A 蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离；

B 分子量测定，蛋白质分子量（球形）的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系；

C 样品脱盐或溶剂置换。

（3）填料要求

一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。

（4）凝胶过滤常用填料种类

目前常用的凝胶包括3个主要类型：

A：葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名称是Sephadex

Polydextran几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。

Sephadex G-X，X表示葡聚糖的交联程度，数值越大则交联度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。

Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关，大概范围如下：

型号   粒度（微米） 有效分离范围（球形蛋白质）

G 10   55－166      <700

G 15   60-180       <1500

G 25   -            1000-5000

G 50   -            1500-30000

G 75   -            3000-80000

G 100  -            4000-150000

G 150  -            5000-300000

G 200  -            5000-600000

Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶，流速快、反压低。

型号      粒度（微米） 有效分离范围（球形蛋白质）

Superdex 30  24-44        <10000

Superdex 75  24-44        3000-70000

Superdex 200              10000-600000

B  聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）

Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状。依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH 值应尽量控制在2-10之间。

型号            粒度（微米） 有效分离范围（球形蛋白质）

Bio-Gel P-2        -      <1800

Bio-Gel P-4        -      800-4000

Bio-Gel P-6        -      1000-6000

Bio-Gel P-10       -      1500-20000

Bio-Gel P-30       -      2500-40000

Bio-Gel P-60       -      3000-60000

C  琼脂糖凝胶

商品名称Sepharose，由属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。

经2，3－二溴丙醇反应交联而成的凝胶为Sepharose CL型凝胶

型号                     粒度（微米） 有效分离范围（球形蛋白质）

Sepharose 2B                70000－40000000

Sepharose 4B                60000－20000000

Sepharose 6B                10000－4000000

Sepharose CL-2B             70000－40000000

Sepharose CL-4B             60000－20000000

Sepharose CL-6B             10000－4000000

Superpose 琼脂糖经多次交联形成的凝胶。

型号            粒度（微米） 有效分离范围（球形蛋白质）

Superose 6          5000－5000000

Superose 12          1000－300000

其它凝胶：聚丙稀酰胺葡聚糖凝胶，交联聚苯乙烯凝胶，聚乙烯醇凝胶等，还有更多新型号的凝胶。

4  操作实例（转载）

1） 凝胶溶胀

凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。