HPLC分析是系统的工作，每个环节都很重要；看似简单的环节，反而容易疏忽，引起整个实验的结果偏差，因此养成良好的习惯是很重要的。色谱柱是色谱系统的心脏，液相色谱柱的正确安装与使用，是色谱工作的关键；也是获得正确可靠的实验数据的必经之路。

一·液相色谱柱的安装

1.液相色谱柱的结构：

  a.空柱由柱接头柱管及滤片组装而成

   柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英才外螺纹，另一端是3/16英才的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英才外螺纹与1/4英寸柱管（￠6.35mm）连接，中间放置压环用于密封。3/16英才的内螺纹与1/16英才（￠1.57mm）的连接管连接，之间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用￠1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后在拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上（连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸。

    在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片（或滤网），用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

   b.柱填料：

    液相色谱柱的分离作用是在填料和流动相之间进行的，柱子的分类是根据填料类型而定。

    正相柱：多以硅胶为填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10um的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，—NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

     反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他反相填料还有键合C8，C4，C2，苯基等，其颗粒直径在3-10um之间。

 2.色谱柱的安装

   a.拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型，尺寸，出厂日期以及柱内储存的溶剂。

   b.拧下柱两端的密封堵头放回包装盒备用。

   c.按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口连接（如条件允许，建议在柱前使用保护柱）；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为.57mm、内径为0.1mm-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈，切记不要用力太大。如色谱柱通过流动相加压后有漏夜现象，请用扳手顺时针拧1/4圈，直至不漏夜为止。

二·液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行的柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只要这样测试的结果才有可比性。

1.样品的前处理：

a.最好使用流动相溶解样品。

b.使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c.使用0.45um的过滤膜除去微粒杂质。

 2.流动相的配置：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a.流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。

b.流动相具有一定的惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。

c.流动相的黏度要尽量的小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液压泵的使用寿命（可运行提高温度的方法降低流动相的黏度）。

d.流动相的化学性质要与使用的检测器相适应。如用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e.流动相的沸点不要太低，负责容易产生气泡，导致实验无法进行。

f.在流动相配置好后，一定进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

 3.流动相流速的选择：

   因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6 mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。

   当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

1）.由于甲醇的廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系（必须使用乙腈的除外）。

2）.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的乙烷做流动相，没有提纯的乙烷不的使用。用水最好使用超纯水（电阻率大于18兆欧），去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析的结果。

3）.含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌的生长。

4）.流动相要求使用0.45um滤膜过滤，除去微粒杂质。

5）.使用HPLC级溶剂配置流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

 4.柱性能的测试：

——启动液相色谱仪：

a. 流动相流速设定为1ml/min。

b．UV检测器波长设定为254nm。

——使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。

——记录并计算测试结果。

高效液相色谱仪操作步骤（原文摘录自网络）：

1）过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2）对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3）打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4） 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。 冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6）调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7）设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8）进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9）关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10）填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1）流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2）柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3）所有过柱子的液体均需严格的过滤。

 ）压力不能太大，最好不要超过2000 psi。

亲和色谱法 affinity chromatography

离子交换色谱法 ion exchange chromatography，IEC

离子色谱法 ion chromatography

离子抑制色谱法 ion suppression chromatography

离子对色谱法 ion pair chromatography

疏水作用色谱法 hydrophobic interaction chromatography

制备液相色谱法 preparative liquid chromatography

平面色谱法 planar chromatography

纸色谱法 paper chromatography

薄层色谱法 thin layer chromatography，TLC

高效薄层色谱法 high performance thin layer chromatography，HPTLC

浸渍薄层色谱法 impregnated thin layer chromatography

凝胶薄层色谱法 gel thin layer chromatography

离子交换薄层色谱法 ion exchange thin layer chromatography

制备薄层色谱法 preparative thin layer chromatography

薄层棒色谱法 thin layer rod chromatography

液相色谱仪 liquid chromatograph

制备液相色谱仪 preparative liquid chromatograph

凝胶渗透色谱仪 gel permeation chromatograph

涂布器 spreader

点样器 sample applicator

色谱柱 chromatographic column

棒状色谱柱 monolith column monolith column

微粒柱 microparticle column

填充毛细管柱 packed capillary column

空心柱 open tubular column

微径柱 microbore column

混合柱 mixed column

组合柱 coupled column

预柱 precolumn

保护柱 guard column

预饱和柱 presaturation column

浓缩柱 concentrating column

抑制柱 suppression column

薄层板 thin layer plate

浓缩区薄层板 concentrating thin layer plate

荧光薄层板 fluorescence thin layer plate

反相薄层板 reversed phase thin layer plate

梯度薄层板 gradient thin layer plate

烧结板 sintered plate

展开室 development chamber

往复泵 reciprocating pump

注射泵 syringe pump

气动泵 pneumatic pump

蠕动泵 peristaltic pump

检测器 detector

微分检测器 differential detector

积分检测器 integral detector

总体性能检测器 bulk property detector

溶质性能检测器 solute property detector

(示差)折光率检测器 [differential] refractive index detector

荧光检测器 fluorescence detector

紫外可见光检测器 ultraviolet visible detector

电化学检测器 electrochemical detector

蒸发(激光)光散射检测器 [laser] light scattering detector

光密度计 densitometer

薄层扫描仪 thin layer scanner

柱后反应器 post-column reactor

体积标记器 volume marker

记录器 recorder

积分仪 integrator

馏分收集器 fraction collector

工作站 work station

固定相 stationary phase

固定液 stationary liquid

载体 support

柱填充剂 column packing

化学键合相填充剂 chemically bonded phase packing

薄壳型填充剂 pellicular packing

多孔型填充剂 porous packing

吸附剂 adsorbent

离子交换剂 ion exchanger

基体 matrix

载板 support plate

粘合剂 binder

流动相 mobile phase

洗脱(淋洗)剂 eluant，eluent

展开剂 developer

等水容剂 isohydric solvent

改性剂 modifier

显色剂 color [developing] agent

死时间 t0，dead time

保留时间 tR，retention time

调整保留时间 t'R，adjusted retention time

死体积 V0，dead volume

保留体积 vR，retention volume

调整保留体积 v'R，adjusted retention volume

柱外体积 Vext，extra-column volune

粒间体积 V0，interstitial volume

(多孔填充剂的)孔体积 VP，pore volume of porous packing

液相总体积 Vtol，total liquid volume

洗脱体积 ve，elution volume

流体力学体积 vh，hydrodynamic volume

相对保留值 ri.s，relative retention value

分离因子 α，separation factor

流动相迁移距离 dm，mobile phase migration distance

流动相前沿 mobile phase front

溶质迁移距离 ds，solute migration distance

比移值 Rf，Rf value

高比移值 hRf，high Rf value

相对比移值 Ri.s，relative Rf value

保留常数值 Rm，Rm value

板效能 plate efficiency

折合板高 hr，reduced plate height

分离度 R，resolution

液相载荷量 liquid phase loading

离子交换容量 ion exchange capacity

负载容量 loading capacity

渗透极限 permeability limit

排除极限 Vh，max，exclusion limit

拖尾因子 T，tailing factor

柱外效应 extra-column effect

管壁效应 wall effect

间隔臂效应 spacer arm effect

边缘效应 edge effect

斑点定位法 localization of spot

放射自显影法 autoradiography

原位定量 in situ quantitation

生物自显影法 bioautography

归一法 normalization method

内标法 internal standard method

外标法 external standard method

叠加法 addition method

普适校准(曲线、函数) calibration function or curve [function]

谱带扩展(加宽) band broadening

(分离作用的)校准函数或校准曲线 universal calibration function or curve [of separation]

加宽校正 broadening correction

加宽校正因子 broadening correction factor

溶剂强度参数 ε0，solvent strength parameter

洗脱序列 eluotropic series

洗脱(淋洗) elution

等度洗脱 gradient elution

梯度洗脱 gradient elution

(再)循环洗脱 recycling elution

线性溶剂强度洗脱 linear solvent strength gradient

程序溶剂 programmed solvent

程序压力 programmed pressure

程序流速 programmed flow

展开 development

上行展开 ascending development

下行展开 descending development

双向展开 two dimensional development

环形展开 circular development

离心展开 centrifugal development

向心展开 centripetal development

径向展开 radial development

多次展开 multiple development

分步展开 stepwise development

连续展开 continuous development

梯度展开 gradient development

匀浆填充 slurry packing

停流进样 stop-flow injection

阀进样 valve injection

柱上富集 on-column enrichment

流出液 eluate

柱上检测 on-column detection

柱寿命 column life

柱流失 column bleeding

显谱 visualization

活化 activation

反冲 back flushing

脱气 degassing

沟流 channeling

过载 overloading