液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。

　　A、 峰拖尾

　　原 因

　　解决方法

　　1、筛板阻塞

　　1、a、反冲色谱柱

　　b、更换进口筛板

　　c、更换色谱柱

　　2、色谱柱塌陷

　　2、填充色谱柱

　　3、干扰峰

　　3、a、使用更长的色谱柱

　　b、改变流动相或更换色谱柱

　　4、流动相PH选择错误

　　4、调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰

　　5、样品与填料表面的溶化点发生反应

　　图

　　5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂

　　b、更改色谱柱

　　B、 峰前延

　　原 因

　　解决方法

　　1、柱温低

　　1、升高柱温

　　2、样品溶剂选择不恰当

　　2、使用流动相作为样品溶剂

　　3、样品过载

　　3、降低样品含量

　　4、色谱柱损坏

　　4、见A1、A2

　　C、 峰分叉

　　原 因

　　解决方法

　　1、 保护柱或分析柱污染

　　图

　　1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。

　　2、样品溶剂不溶于流动相

　　2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。

　　D、 峰变形

　　原 因

　　解决方法

　　1、样品过载

　　1、减少样品载量

　　E、 早出的峰变形

　　原 因

　　解决方法

　　1、样品溶剂选择不恰当

　　1、a、减少进样体积

　　b、运用低极性样品溶剂

　　F、 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰

　　原 因

　　解决方法

　　1、柱外效应

　　1、a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路)

　　b、使用小体积的流通池

　　G、 K’增加时，脱尾更严重

　　原 因

　　解决方法

　　1、二级保留效应，反相模式

　　1、a、加入三乙胺(或碱性样品)

　　b、加入乙酸(或酸性样品)

　　c、加入盐或缓冲剂(或离子化样品)

　　d、更换一支柱子

　　2、二级保留效应，正相模式

　　2、a、加入三乙胺(或碱性样品)

　　b、加入乙酸(或酸性样品)

　　c、加入水(或多官能团化合物)

　　d、试用另一种方法

　　3、二级保留效应，离子对

　　3、加入三乙胺(或碱性样品)

　　H、 酸性或碱性化合物的峰拖尾

　　原 因

　　解决方法

　　1、缓冲不合适

　　1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液

　　b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液

　　I、 额外的峰

　　原 因

　　解决方法

　　1、样品中有其他组份

　　1、正常

　　2、前一次进样的洗脱峰

　　2、a、增加运行时间或梯度斜率

　　b、提高流速

　　3、空位或鬼峰

　　3、a、检查流动相是否纯净

　　b、使用流动相作为样品溶剂

　　c、减少进样体积

　　J、 保留时间波动

　　原 因

　　解决方法

　　1、温控不当

　　1、调好柱温

　　2、流动相组分变化

　　2、防止变化(蒸发、反应等)

　　3、色谱柱没有平衡

　　3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

　　K、 保留时间不断变化

　　原 因

　　解决方法

　　1、流速变化

　　1、重新设定流速

　　2、泵中有气泡

　　2、从泵中除去气泡

　　3、流动相选择不恰当

　　3、a、更换合适的流动相

　　b、选择合适的混合流动相

　　L、 基线漂移

　　原 因

　　解决方法

　　1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)

　　1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器

　　图

　　2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)

　　2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。

　　3、流通池被污染或有气体

　　3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。(不要用盐酸)

　　4、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线)

　　4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

　　5、流动相配比不当或流速变化

　　5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

　　6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时

　　6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

　　7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成

　　7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

　　8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。

　　8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

　　9、使用循环溶剂，但检测器未调整。

　　9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。

　　10、检测器没有设定在最大吸收波长处。

　　10、将波长调整至最大吸收波长处

　　M、 基线噪音(规则的)

　　原 因

　　解决方法

　　1、在流动相、检测器或泵中有空气

　　1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

　　2、漏液

　　图

　　2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。

　　3、流动相混合不完全

　　3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂

　　4、温度影响(柱温过高，检测器未加热)

　　4、减少差异或加上热交换器

　　5、在同一条线上有其他电子设备

　　5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。

　　6、泵振动

　　6、在系统中加入脉冲阻尼器

　　N、 基线噪音(不规则的)

　　原 因

　　解决方法

　　1、 漏液

　　图

　　1、见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。

　　2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成

　　2、检查流动相的组成。

　　3、流动相各溶剂不相溶

　　3、选择互溶的流动相

　　4、检测器/记录仪电子元件的问题

　　4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。

　　5、系统内有气泡

　　5、用强极性溶液清洗系统

　　6、检测器内有气泡

　　6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器

　　7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。)

　　7、用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

　　8、检测器灯能量不足

　　8、更换灯

　　9、色谱柱填料流失或阻塞

　　9、更换色谱柱

　　10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常

　　10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置

　　O、 宽峰

　　原 因

　　解决方法

　　1、流动相组成变化

　　1、重新制备新的流动相

　　2、流动相流速太低

　　2、调节流速

　　3、漏液(特别是在柱子和检测器之间)

　　3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。

　　4、检测器设定不正确

　　4、调整设定

　　5、柱外效应影响

　　a、柱子过载

　　b、检测器对反应时间或池体积响应过大

　　c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大

　　d、记录仪响应时间太长

　　图

　　5、

　　a、 小体积进样(例如：10ul而不是100ul)以1：10或1：100的比例稀释样品

　　b、减少响应时间或使用更小的流通池

　　c、 使用内径为0.007-0.01的短管路

　　d、减少响应时间

　　6、缓冲液浓度太低

　　6、增加浓度

　　7、保护柱污染或失效

　　7、更换保护柱

　　8、色谱柱污染或失效，塔板数较低

　　8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。

　　9、柱入口塌陷

　　9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子

　　10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰

　　10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果

　　11、柱温过低

　　11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃

　　12、检测器时间常数太大

　　12、使用较小的时间常数

　　P、 分离度降低

　　原 因

　　解决方法

　　1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)

　　1、重新配置流动相

　　2、保护柱或分析柱阻塞

　　图

　　2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

　　Q、 所有的峰面积都太小

　　原 因

　　解决方法

　　1、检测器衰减设定过高

　　1、减少衰减的设定

　　2、检测器时间常数设定太大

　　2、设定较小的时间常数

　　3、进样量太少

　　3、增大进样量

　　4、记录仪连接不当

　　4、使用正确的连接

　　R、 所有的峰面积都太大

　　原 因

　　解决方法

　　1、检测器衰减设定过低

　　1、采取较大的衰减

　　2、进样过多

　　2、减少进样量

　　3、记录仪连接不正确

　　3、正确连接记录仪

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分 析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技 术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率 高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。
　　气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合 物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过 气相色谱，位居色谱法之首。

高效液相色谱的类型

　　广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相 色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。

　　通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离 子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表8-1列举了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在 应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。

表8-1 HPLC按分离机理的分类

类 型	主 要分离机理	主要分析对象或应用领域
吸附色谱	吸附能，氢键	异构体分离、族分离，制备
分配色谱	疏水分配作用	各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱	溶质分子大小	高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱	库仑力	无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱	Donnan膜平衡	有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱	疏水分配作用	离子性物质分析
疏水作用色谱	疏水分配作用	蛋白质分离与纯化
手性色谱	立体效应	手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱	生化特异亲和力	蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析

液相色谱仪流程图

　　现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合 起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗 脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。

　　液相色谱仪的工作 过程：输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中 的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。