一、原理

　　培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

　　在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

　　用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

　　二、仪器、用品与试剂

　　1. 仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪(或分光光度计)

　　2. 试剂：0.4%台盼兰，0.5%四甲基偶氮唑盐(MTT)、酸化异丙醇

　　3. 材料：细胞悬液

　　三、操作步骤

　　1. 细胞计数

　　① 将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

　　② 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

　　③ 静置3分钟。

　　④ 镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

　　细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10000

　　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

　　2. 细胞活力

　　① 将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

　　② 加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

　　③ 吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

　　④ 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

　　3. MTT法测细胞相对数和相对活力

　　活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

　　① 细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。

　　② 沉淀加入0.5-1ml MTT，吹打成悬液。

　　③ 37℃下保温2小时。

　　④ 加入4—5 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。

　　⑤ 1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。

　　注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

　　附：1、0.4%台盼兰染液配制：

　　1. 台盼兰 0.4克加双蒸水至100 ml。

　　2. MTT配制：

　　MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。

　　3. 酸化异丙醇配制：

　　异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。

　　1、如何保持CO2培养箱中水盘的清洁?

　　CO2 培养箱内底部一般配有一个水盘，用以维持CO2培养箱内的湿度。水盘内的水要定期更换和添加，水盘也要定期清洗以避免微生物的生长。为了减少微生物的污染，有一些CO2培养箱提供灭菌功能。有的可以加热到比较高的温度来灭菌，有的则通过让空气循环通过一个紫外线腔体的办法来灭菌，这样就灭菌时就不需要中断细胞的培养。

　　2、为什么放置在4oC冰箱中的原代细胞培养基会发生颜色变化?

　　原代细胞培养基需保存4°C冰箱中。如原代细胞培养基中长生的CO2会逐渐溢出后，造成原代细胞培养基越来越偏碱性(pH大于7.4)。而原代细胞培养基中酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。原代细胞培养基偏碱后再用于细胞培养将造成原代细胞生长停滞或死亡。原代细胞培养基如偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2，以调整pH值。

　　用新鲜的原代细胞培养基进行细胞培养。

　　3、购置的血清一定要进行灭活处理吗?

　　血清灭活处理对大多数的原代细胞培养并非必需的。

　　高温灭活处理的血清可能带来的问题：

　　(1)影响血清的质量，此血清造成原代细胞生长速率的降低。

　　(2)沉淀物的形成增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察时像是“小黑点”，常会误为是原代细胞培养污染。

　　高温灭活处理的血清放在37°C环境中，沉淀物增多，此非微生物的分裂扩增。

　　购置高质量、好品牌的血清，无需灭活处理。

　　4、血清最好的保存方法是什么?

　　500ml血清需分装保存。

　　血清长期保存需放置在-20°C。

　　血清在4℃保存时，请勿超过一个月。

　　500ml血清分装为每50ml/管，-20°C保存。

　　5、冻存的血清如何解冻?

　　血清从冷冻箱取出，放置4°C处24小时，然后放置室温至全融。

　　冻存血清融解过程中，必须规则地摇晃均匀。

　　6、为什么解冻血清后有絮状沉淀物出现?如何处理和避免?

　　解冻血清后有絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。

　　解冻血清后有絮状沉淀物出现主要原因：

　　(1)血清中脂蛋白的变性所造成;

　　(2)血纤维蛋白存在于血清中;

　　处理和避免解冻血清后有絮状沉淀物出现：

　　(1)解冻后血清离心至絮状物沉淀,上清液过滤;

　　(2)解冻后血清切勿直接过滤;

　　(3)解冻步骤：-20°C～4°C室温;

　　(4)热灭活血清易造成沉淀物增多，多无须此步骤。

　　(5)热灭活血清原则：56°C、30分钟、摇晃均匀。

　　冻存血清融解过程或热灭活时，必须规则地摇晃均匀。

　　7、为什么原代细胞培养生长减慢?

　　原代细胞培养生长减慢原因：

　　(1)原代细胞培养基和添加基的配置或选购不当;

　　(2)胎牛血清质量不高或保存不当;

　　(3)缺乏或已被破坏细胞生长必需成分：如谷氨酰胺、生长因子;

　　(4)细菌或真菌等微生物污染;

　　(5)培养条件不正确如温度、湿度、CO2浓度;

　　原代细胞培养体系、微生物污染、培养条件三种因素。

　　8、细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗?

　　不见得!因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下pH8.0、温度37°C其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：

　　(1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;

　　(2)0.25% 胰蛋白酶

　　多数细胞传代消化可使用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。

　　9、为什么原代细胞冷冻管经解冻后会发现细胞数目减少或太少?

　　原代细胞冷冻管经解冻后，再离心是造成细胞数目减少或太少的主要原因。

　　原代细胞解冻后不要立刻离心。

　　10、为什么原代细胞培养时需使用5%CO2或10%CO2?

　　原代细胞培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。

　　原代细胞培养基使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统。

　　当原代细胞培养基中NaHCO3含量为每公升1.5g时，原代细胞细胞培养时应使用5%CO2。

　　当原代细胞培养基中NaHCO3含量为每公升3.7g时，原代细胞细胞培养时应使用10%CO2。

　　原代细胞培养基中NaHCO3为每公升1.5g时，原代细胞细胞培养时应使用5%CO2。

　　11、原代细胞培养解冻培养时如何去除DMSO?

　　除少数原代细胞对DMSO敏感之外，绝大部分原代细胞培养，在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜原代细胞培养基中，隔日再换新鲜原代细胞培养基去除DMSO。

　　隔日换新鲜原代细胞培养基时，去除DMSO。

　　12、原代细胞培养出现死亡常见原因有什么?

　　(1)培养箱内CO2浓度;

　　(2)培养箱内温度稳定;

　　(3)培养箱内温度湿度;

　　(4)细胞冻存过程;

　　(5)细胞复苏过程;

　　(6)原代细胞基础培养基;

　　(7)原代细胞培养添加剂;

　　(8)血清的质量;

　　(9)操作人员技术;

　　原代细胞基础培养基和原代细胞培养添加剂尤为重要。

　　13、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?

　　L-谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。

　　L-谷氨酰胺降解率随保存温度而变。细胞生物学技术服务

　　L-谷氨酰胺降解致氨形成，氨对细胞具有毒性作用。

　　使用新鲜的L-谷氨酰胺。

　　14、原代细胞基础培养基及原代细胞培养添加物可反复冻融吗?炎症检测技术服务

　　原代细胞基础培养基不要冻融，放置4°C保存。

　　原代细胞培养添加物最多可以冻融3次。

　　15、原代细胞培养体系中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗?

　　原代细胞培养体系中添加了血清和抗生素后，放置4°C保存可使用3-4周。

　　使用小包装(250ml或100ml)的原代细胞培养体系。

　　16、如何处理原代细胞支原体污染?

　　(1)直接对培养原代细胞灭菌后丢弃;

　　(2)清洁环境;

　　(3)重新评估原代细胞培养体系的无菌;

　　(4)重新评估原代细胞培养无菌操作技术;

　　17、原代细胞冷冻保存应用DMSO的注意事项有哪些?

　　Sigma D2650 Tissue culture grade用于原代细胞冷冻保存。

　　DMSO为无菌状况。

　　DMSO第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。

　　DMSO要过滤，须使用耐DMSO的Nylon滤膜。

　　原代细胞培养时，需购置原装Sigma的DMSO。

说到病毒，拿我们现在贼讨厌的新冠病毒COVID-19: SARS-coV-2来举例，它的遗传物质是RNA。如果SARS-CoV-2大流行给我们带来了任何启示，那么对RNA修饰的研究现在比以往任何时候都更加重要。 这是否意味着要研究病毒RNA本身以更多地了解不同的改变和表观遗传学变化如何使这些病毒更具弹性和更具感染力，或者研究从细胞和组织中收集的RNA以了解这些不同病原体对宿主细胞功能的影响，这项研究努力几乎是无尽的。RNA m6A的原理和概念我今日就不再赘述，今天就开门见山的聊聊病毒 RNA m6A.

 

一 m6A修饰对RNA病毒生命周期的影响

 

已知表观遗传修饰会影响人冠状病毒等RNA病毒的生命周期。据报道，像N6-甲基腺苷(m6A)这样的修饰腺苷通过调节病毒帽结构、病毒基因表达、病毒子代、先天性感应途径和先天性免疫反应来影响特定RNA病毒的生存能力。m6A的获得或丧失可导致RNA病毒发生显著的功能变化，改变宿主细胞的融合/进入、复制、传播、病原体强度和免疫逃避。宿主细胞的m6A表型组在宿主抵抗力中起着重要作用，病毒感染后也可发生改变。SARS-CoV-2基因组长度超过29800个核苷酸，根据RNA甲基化酶复合物METTL3/14对m6A修饰的特定序列座的存在，包括GGACU(T)、GGACA和GGACC，包含50多个潜在的m6A位点。因此，SARS-CoV-2 RNA中>0.64%的腺苷，或0.18%的碱基可能是m6A。因此，总RNA中m6A的定量和全转录组m6A图谱的绘制对于研究m6A相关的病毒功能和相应的机制，以及确定新的抗病毒治疗靶点至关重要。

 

二 病毒RNA提取

 

无论您是从细胞，组织还是病毒的样品开始，有效的RNA分离通常是成功进行实验的步。对于病毒：另一方面，当涉及病毒样品时，诸如病毒滴度低和污染性宿主核酸的高存在之类的挑战需要使用补充技术来确保产量和纯度符合下游要求。在我们zui近的公告文章中，我们概述了可以完成此操作的10种方法，因此您可以将其应用到zui适合您的学习的方法中。一种方法是接种细胞培养物进行病毒扩增，然后收集扩增的病毒体，以与EpiGentek的病毒RNA提取试剂盒一起使用。注意：对于直接从临床标本中提取的病毒RNA，在m6A RNA富集之前，需要额外的处理以去除共提取的宿主DNA和rRNA污染物。

 

三 病毒RNA提取试剂盒

 

病毒RNA提取产品我们主要有2种：RNA稳健的旋转柱和磁性试剂盒我们的每一个试剂盒都是为了提取高质量的RNA而设计的，除了用于RT-PCR之外，还可以用于其他下游应用。我们的试剂盒在提取方法以及通量选项（高/手动）的类型上有所不同，因此无论您的实验室需要什么，我们的试剂盒都可以帮助您获得随时可用的纯化病毒RNA。我们的各种磁珠和自旋柱试剂盒可以从不同的样品来源（鼻腔/鼻咽拭子、细胞/组织）和物种（病毒、哺乳动物）中分离RNA。洗涤剂和潮解盐用于裂解细胞和灭活RN酶。专门的高盐缓冲系统使RNA碱基与磁珠结合到自旋柱的玻璃纤维基质上，同时污染物被有效地洗去。纯核酸用水缓冲液洗脱，不需要苯酚提取或酒精沉淀。具体操作流程如下：

 

 

结果：

 

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