关于PCR仪的知识，大家应该还有很多方面不太了解的。比如梯度PCR、传统的PCR及原位PCR在基因扩增方面的不同用途及区别大家就不是很熟悉。下面就为大家简单介绍一下：

　　梯度PCR是把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度)，通常 12钟温度梯度，这样的仪器。因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表大量高的最适退火温度，进行有效的扩增。梯度PCR，在不设置徒弟的情况下也可以做普通PCR扩增。

　　传统的PCR是把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR，也叫普通PCR。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的，对目的基因退火温度的扩增。

　　原位PCR是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。

　　这三种基因扩增PCR，是我们在实验室中常用常见的，大家了解了它们之间的区别及不同使用方式、用途等，相信对于您以后选择PCR仪一定可以提供有效的参考。

　　PCR技术基本原理

　　PCR技术的基本原理:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基蚶┰龇糯蠹赴偻虮丁5酱锲教ㄆ?Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

　　PCR的反应动力学

　　PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

　　PCR扩增产物

　　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

　　关于PCR假阴性问题的总结PCR的假阳性问题深受重视，但PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性却不同，它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。就临床而言，大三阳检出率低、甚至于GC镜下都很多时，PCR仍为阴性的事情也经常发生，可见假阴性问题的严重性。就PCR假阴性问题总体来说有如下因素：一、仪器因素 PCR实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。扩增仪的主要问题是孔间差，引起扩增失败可扩增效率降低。而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用离心加速度(XXXg)作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的大小不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大(有的在数倍以上)，所以在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有，但因基他实验都是测定大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。

　　二、试剂质量问题 PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解;模板的抽提;引物位点的选择;Taq酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。

　　三、核酸模板问题核酸模板质量问题是制约PCR最重要的因素之一。核酸模板在扩增区出现断裂、蛋白粘附、空间位阻等模板质量问题都有可能引起扩增失败造成结果的假阴性或定量不准确。由于无论什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板质量虽然与试剂的质量有关，但它不可能由试剂质量完全解决。核酸模板问题除了模板本身的问题外，还存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分(如某些蛋白、离子等)作用，而导致扩增效率降低甚至扩增失败的问题。对此，有人提倡进行模板纯化，效果较为明显。但另一个问题又出现了，那就是怎样保证纯化的回收率问题。总之，核酸模板问题是不可避免的问题，只能努力去减少。

　　四、操作人员素质问题 PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误、对于RNA抽提降解、逆转录失败等等都能造成结果的假阴性。因此要求PCR的实验操作人员有很好的素质，能够严格遵守操作规程，并能敏锐的发现问题和解决问题。五、其他 PCR实验中从样品的采集、运输、保存开始就可以引起结果的假阴性，而对于病原体检测(如HBV)在人体血液系统出现有周期性变化也是值得注意的因素。

　　1、仪器的检测通量在购买定量PCR仪的时候要根据实验实的需要来选择不同通量的仪器。目前市面上的荧光定量PCR的检测通量小到16个多到384个。如果进行一般的基因表达研究或病原体检测，实在不必购买昂贵的仪器，96孔的通量足够用;需要寻找要新药靶点和疾病标记的实验室可以考虑购买384孔板的仪器。假如经费有限无法购买384孔板仪器的实验室，可以考虑购买运行速度快(带有FAST模块)的96孔板荧光定量PCR仪。有了高通量的仪器，你会发现样品的制备和小体系、多样本的PCR体系构建成为限制实验速度和结果的颈瓶。

　　2、硬件设计特点荧光定量PCR仪主要有传统的96孔板式、创新的离心式等，每种设计都有它的独到之处但也都有无法避免的缺憾。传统的96孔板的荧光定量PCR可以容纳的样本量大，而且无需特殊的耗材。有些传统的96孔板的仪器采用卤钨灯激发、CCD检测，这些光学结构在96孔板的顶部，每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同——边缘效应，对结果产生影响。为了保证精确、准确的实验结果，这类仪器在实验过程中通常会使用ROX(一种荧光染料) 或专用的Reference dye作为参照校正实验结果。卤钨灯的使用寿命短、更换成本较高已经成为很多用户头痛的问题。在实验过程中卤钨灯作为一种热光源，产生较多热能对实验结果有一定的影响。CCD最大的优点就是可以同时扫描所有样品中的荧光信号，但是灵敏度较低，而且同时检测样品间的荧光信号存在干扰。创新的离心式的仪器通常选用LED激发、PMT检测，离心式的设计上避免了边缘效应。LED光源是冷光源对实验没有影响，因此无需采用其他荧光染料校正仪器，而且使用寿命长无需经常更换。PMT每次只能收集单个荧光信号，但是检测灵敏度高。但这类仪器运行速度非常快，但也存在样本量小、耗材昂贵、没有梯度功能、存在时间积分等缺点。随着荧光定量PCR技术的使用，聪明的仪器生产商纷纷在传统的96孔板仪器上大作改进。首先是Stratagene的Mx3000p在检测上突破了使用CCD改用PMT检测荧光信号，大大提高了实验的灵敏度，但激发光源仍然沿用传统的卤钨灯并且没有梯度功能。

　　3、运行速度在荧光定量PCR仪的众多技术参数中，升降温速度也是厂家喜欢大力宣传的指标。更快的升降温，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间，提高PCR的特异性。为了更好的完成实验，各个厂家纷纷推出能快速运行的荧光定量PCR仪。例如ROCHE推出的 Lightcycler2.0利用空气动力学原理，可在半小时左右完成30-40个循环。ABI的7500可以选配FAST模块拥有5°C/秒的升降温速度，可在40分钟左右完成30-40个循环。

　　4、灵活性大规模繁忙的实验室设备固然让人羡慕，但是常规实验室同样可以有精彩的选择。现在的仪器供应商拥有众多技术专家，有的还能提供整个分子生物学的基础研究平台，不但了解、满足您现在的需求，而且还考虑到了你可能变化的需求——升级和更换模块。Bio-rad的Mycycler就可以选择模块升级为定量PCR仪。ABI的7900可以选择将96孔槽变为384孔槽。像离心式的双通道的Rotor-gene3000A 就可以根据您研究的需要升级成四通道的荧光定量PCR仪。

　　荧光定量PCR选择的两个误区：

　　误区一：仪器通道越多越好

　　随着PCR技术的成熟运用，多重扩增越来越热闹，荧光定量PCR仪也不能幸免。从最初ABI公司推出的单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪，眼花缭乱的选择让人无所适从，就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。

　　在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时，为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料) 或专用的Reference dye ，这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来，真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个，而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的，有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要，不能单单只听宣传。考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发，多重PCR并非人人适用、人人可用，因为它使实验复杂化了。

　　误区二：real-time PCR仪无需梯度功能

　　对于使用染料法的定量PCR反应，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值)，但运用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果，退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出最适合的反应条件。

　　不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要，因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异，优化延伸温度就显得很重要。

　　使用有梯度功能的荧光定量PCR可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程，简化了摸索 PCR反应条件的繁琐实验，既节省实验时间提高效率，又节省实验成本。

　　一、聚合酶链反应的历史回顾

　　1、核酸体外扩增最早的设想

　　由 Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。

　　2、聚合酶链反应的发明

　　1985 年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。

　　二、聚合酶链反应相关技术的发展

　　PCR 及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题;第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。

　　名　称 主要用途

　　简并引物扩增法 扩增未知基因片段

　　巢居PCR 提高PCR敏感性、特异性，分析突变

　　复合PCR 同时检测多个突变或病原

　　反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变

　　单一特异引物PCR 扩增未知基因组DNA 单侧引物PCR 通过已知序列扩增未知cDNA

　　锚定PCR 分析具备不同末端的序列

　　增效PCR 减少引物二聚体，提高PCR特异性

　　固着PCR 有利于产物的分离

　　膜结合PCR 去除污染的杂质或PCR产物残留

　　表达盒PCR 产生合成或突变蛋白质的DNA片段

　　连接介导PCR DNA甲基化分析、突变和克隆等 RACE-PCR 扩增cDNA末端

　　定量PCR 定量mRNA或染色体基因

　　原位PCR 研究表达基因的细胞比例等

　　臆断PCR 鉴定细菌或遗传作用

　　通用引物PCR 扩增相关基因或检测相关病原

　　信使扩增表型分型(mapping) 同时分析少量细胞的mRNA

　　三、其它扩增技术

　　与PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊，与PCR互为补充，有的可结合应用，共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信，随着分子生物学技术的发展，这一家族一定会再涌现出新成员。

　　技术 应用

　　转录依赖的扩增系统(TAS) 检测HIV

　　连接酶链反应(LCR) 检测点突变

　　自主序列复制(3SR)系统 研究RNA，临床应用、法医学等

　　链替代扩增(SDA) 检测、鉴定基因

　　Qβ复制酶系统 增加探针检测敏感性

　　循环探针反应 增加探针检测敏感性

　　连接酶链反应 (A)

　　连接酶链反应(Ligase　chain　reaction，LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测 技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增。是Backman　1997年为检出靶基因序列 中的点突变而设计发明，并申报了专利。

　　LCR的基本原理为利用DNA连接酶。特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连 接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增。

　　LCR 的扩增效率与PCR相当，用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环，94℃min变性 和65℃复性并连接，循环30次左右。其产物的检测也较方便灵敏。目前该方法主要用 点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等，还可用于单碱基遗传病多 态性及单碱基遗传病的产物诊断，微生物的种型鉴定，癌基因的点突变研究等。

　　依赖核酸序列的扩增 (A)

　　依赖核酸序列的扩增(Nucleic　acid　sequence-based　amplification,NASBA) ，又称自主序列复制系统(self-sustained　sequence　replication，3SR)或再生长 序列复制技术。1990年Guatelli等首先报道了这一技术。

　　NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序。

　　其基本方法为：将引物,标本加入扩增反应液，65℃1min使RNA分子二级结构打 开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNase　H,并在37℃反应1～1.5小时,其 产物经琼脂糖电泳，溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带。

　　NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。

　　转录依赖的扩增系统 (A)

　　转录依赖的扩增系统(Transcript-based　amplification　sytem，TAS)，是 Kwen等人于1989年研究报道的，主要用于扩增RNA。

　　TAS的主要特点是扩增效率高，因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加，只需6个 循环靶序列的拷贝数就能达到2×106。它的另一个特点是特异性高，由于TAS只能进行 6次温度循环，错掺率低，加之用葡聚糖珠夹心杂交，因而特异性也高。

　　虽然本法有较高的特异性和敏感性，但其循环过程复杂，需重复加入逆转录酶和 T7RNA多聚酶，有待进一步研究。

　　Qβ复制酶反应 (A)

　　Kacian 等于1972年首次报报Qβ复制酶(Q-beta　replicase)催化RNA模板的自我 复制功能，它能在常温30min，将其天然模板MDV-1RNA扩增至109。1986年Chu等报道 用生物标记的靶序列特异性探针，可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交，经洗脱未被结合 的MDV-1后，再加入Qβ复制酶，扩增复制MDV-1拷贝，然后用溴乙锭染色检测或用同 源性的第二探针杂交。

　　Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶，它有3个特点：①不需寡核苷酸引物的引 导就可启动RNA的合成。②能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有 的RNA折叠结构。③在Qβ复制酶的天然模板MDV-1　RNA的非折叠结构区插入一短的 核酸序列不影响该酶的复制。　因而，如在此区插入核酸探针，则其序列照样可能被 Q　β复制酶扩增。

　　1988年Lizardi等，将靶基因序列插进MDV-1质粒里，用T7RNA聚合酶催化转录 出MDV-1　RNA探针，这种RNA探针可与靶序列杂交，然后洗去非杂交的探针,加入Qβ 复制酶来扩增探针，被扩增的探针又可作为模板进行扩增，并呈指数递增。其产物 按上述两种方法进行检测。现在该技术又发展了夹心杂交法，分子开关和靶依赖的复 制等技术。

　　四、PCR技术的应用举例

　　研究：基因克隆;DNA测序;分析突变;基因重组与融合;鉴定与调控蛋白质结合DNA序列;转座子插入位点的绘图;检测基因的修饰;合成基因的构建;构建克隆 或表达载体;检测某基因的内切酶多态性

　　诊断：细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等);病毒(HTLV、HIV、 HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19);寄生虫(疟疾 等);人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)

　　免疫学：HLA分裂;T细胞受体或抗体多样化的定性;自身免疫病基因作图;淋巴因子定量

　　人类基因组工程：用散布重复序列产生DNA标志;遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图);物理图谱的构建;测序，表达图谱

　　法医：犯罪现场标本分析;HLA-DQ

　　肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤

　　组织和群体生物学：遗传聚类研究;动物保护研究;生态学;环境科学;实验遗 传学古生物学：考古与博物馆标本分析

　　动物学：动物传染病的诊断等

　　植物学：检测植物病原等